Utilitatea testului
Acest test este util pentru a confirma prezenţa anticorpilor IgG specifici faţa de virusul hepatitei C în probele de ser care au dat rezultate reactive (pozitive) la testele screening anti-HCV (efectuate prin tehnici ELISA sau similare acestora). Este folosit mai ales în băncile de sânge. Spre deosebire de testele screening, testul de confirmare permite, prin separarea electroforetică a antigenelor, o detectare a anticorpilor asociaţi cu diferite etape ale infecţiei1;2;3;4;5.
Datorită îmbunătăţirii performanţei testelor screening şi dezvoltării tehnicilor moleculare testul de confirmare este din ce în ce mai mult rezervat cazurilor în care s-au obţinut rezultate slab pozitive la etapa de screening1;3.
Pregătire pacient – preferabil à jeun (pe nemâncate)4.
Specimen recoltat – sânge venos4.
Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator4.
Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare în ziua recoltării4.
Volum probă – minim 2 mL ser4.
Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat; specimen contaminat bacterian4.
Stabilitate probă – serul este stabil 6 zile în condiţii ambientale; 7 zile la 2-8°C; timp îndelungat la -20°C; evitaţi decongelarea/recongelarea repetată4.
Metodă – Imunoblot
Testul utilizează 6 antigene HCV recombinate purificate, relevante serologic, care sunt separate pe baza greutăţii moleculare prin electroforeză în gel de poliacrilamidă în prezenţă de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE) şi transferate ulterior electroforetic pe o membrană de nitroceluloză (Western blotting). Situsurile de legare libere de pe membrană sunt saturate cu o soluţie de proteine, după care matricea este spălată şi tăiată în fâşii (strip-uri). Antigenele sunt reprezentate, în ordinea fixării pe strip, de:
Într-o primă etapă strip-ul încărcat cu antigenele HCV este incubat împreună cu serul diluat al pacientului. Dacă în ser sunt prezenţi anticorpi specifici aceştia se vor lega de antigenele corespunzătoare de pe strip. După o etapă de spălare, strip-ul este incubat cu un conjugat anti-IgG uman marcat cu peroxidază. Conjugatul se va ataşa la porţiunea IgG a complexului antigen-anticorp. După îndepărtarea prin spălare a conjugatului nelegat se adaugă soluţia de colorare – un sistem de detecţie enzimatică colorimetrică care conţine peroxid de hidrogen şi 4-cloro-1-naftol. Dacă este prezent conjugatul legat reacţia enzimatică va genera un produs colorat albastru-închis la nivelul benzilor ocupate de anticorpi specifici. Astfel, benzile vizualizate la nivelul stripului sunt rezultatul legării anticorpilor specifici de antigenele individuale recombinate de la nivelul strip-ului.
Prin acest test sunt detectaţi anticorpii specifici faţă de cele 6 genotipuri HCV4.
Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor
Intensitatea benzilor probelor este comparată cu cea a benzii controlului cut-off prezent pe fiecare strip. Sunt posibile următoarele exprimări semicantitative:
Intensitate bandă
| Exprimare rezultat | |
| Absentă | – |
| Intensitate mai mică decât cea a benzii controlului cut-off | +/- |
| Intensitate comparabilă cu cea a benzii controlului cut-off | + |
| Intensitate mai mare decât cea a benzii controlului cut-off | ++ |
| Intensitate foarte mare | +++ |
Interpretarea definitivă a rezultatelor testului se face cu ajutorul unui software (după scanarea strip-urilor), criteriile utilizate fiind menţionate în tabelul de mai jos4:
| Criterii |
Rezultat test Imunoblot |
| • Niciun antigen ≥ control cut-off sau• NS3, NS4 sau NS5 izolate ≥ control cut-off |
Negativ |
| • Core 1 izolat ≥ control cut-off sau• Core 2 izolat ≥ control cut-off sau
• Helicază izolată≥ control cut-off sau • Helicază şi o proteină NS (NS3, NS4 sau NS5) ≥ control cut-off sau • Alte 2 antigene ≥ control cut-off |
Echivoc |
| • Core 1 şi Core 2 ≥ control cut-off sau• Core 1 şi un alt antigen ≥ control cut-off sau
• Core 2 şi un alt antigen ≥ control cut-off sau • 3 antigene ≥ control cut-off |
Pozitiv |
Un rezultat pozitiv confirmă prezenţa anticorpilor specifici anti-HCV datoraţi unei infecţii în antecedente sau cronice.
Un rezultat echivoc indică faptul că prezenţa anticorpilor anti-HCV este incertă; testul trebuie repetat la un interval de 3-4 săptămâni pentru a determina statusul definitiv anti-HCV. Sunt posibile următoarele situaţii în cazul unui rezultat echivoc:
Rezultatele echivoce trebuie interpretate în contextul clinic şi epidemiologic al pacientului (existenţa factorilor de risc pentru infecţia HCV). La pacienţii imunodeprimaţi cu risc crescut de a dezvolta infecţie, dar care prezintă un rezultat echivoc la testul de confirmare se indică ARN viral hepatită C.
Un rezultat negativ indică absenţa anticorpilor specifici anti-HCV şi un rezultat fals-pozitiv la testele screening1;2;3.
Analiza răspunsului imun după o infecţie HCV recentă indică faptul că anticorpii faţă de NS3 şi antigenul core apar în mod obişnuit cu câteva săptămâni înaintea anticorpilor anti- NS4 şi NS5. În timp ce anticorpii anti-NS3 sunt aproape întotdeauna detectabili, anticorpii faţă de antigenul core pot fi iniţial absenţi, în special în cazul infecţiilor auto-limitante sau asimptomatice, şi la aproximativ o treime din pacienţi nu apar decât în faza cronică.
În infecţia HCV cronică apare de obicei întreaga paletă de anticorpi. Cu toate acestea, intensitatea benzilor variază semnificativ în decursul infecţiei. În eventualitatea unui spectru incomplet de benzi, care este întâlnit în special la pacienţii imunodeprimaţi, anticorpii anti-NS4 şi anti-NS5 sunt în mod obişnuit absenţi.
După vindecarea infecţiei HCV anticorpii specifici dispar de obicei în decurs de câţiva ani; anticorpii faţă de antigenul core persistă cel mai mult2.
Limite şi interferenţe
Bibliografie
