Anticorpi antinucleari (imunofluorescență)

Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Identificarea anticorpilor antinucleari (ANA) reprezintă o parte importantă a imunologiei clinice.

Anticorpii antinucleari sunt anticorpi îndreptaţi impotriva antigenelor nucleare şi au fost descrişi într-o multitudine de afecţiuni autoimune sistemice şi organ-specifice.

Testul ANA îşi are originea în fenomenul L.E care a fost evidenţiat pentru prima oară în 1948 de către Haargraves, Richmond şi Morton. Totuşi, determinarea celulelor lupice s-a dovedit a fi un test puţin sensibil şi dificil de standardizat.

În 1950, Coons şi Kaplan au utilizat anticorpi specifici marcaţi cu fluoresceină pentru identificarea antigenelor tisulare. În 1957, Holborow, Weir şi Johnson au folosit pentru prima dată tehnica imunofluorescenţei pentru a demonstra că serul pacienţilor LE pozitivi conţine anticorpi care produc o fluorescenţă nucleară omogenă pe ţesuturile umane. În 1961, Beck a descris  şi alte tipuri de fluorescenţă nucleară în serul pacienţilor cu diferite afecţiuni reumatice utilizând secţiuni de ficat de şobolan.

Substratul ANA tradiţional a fost reprezentat mult timp de secţiuni de ficat, rinichi sau stomac de şobolan. Înlocuirea acestui substrat a fost realizată cu mult succes de linia celulară Hep-2 (human epithelial type 2 cells) izolată iniţial de la un carcinom laringian uman, aceasta permiţând recunoaşterea a peste 30 pattern-uri nucleare şi citoplasmatice determinate de peste 100 autoanticorpi diferiţi. Avantajele utilizării celulelor Hep-2 faţă de substratul animal sunt:

• sensibilitate mai mare care permite identificarea mai multor pattern-uri;
• originea umană asigură o mai bună specificitate decât cea animală;
• nucleii celulelor sunt mai mari, iar detaliile nucleare pot fi evidenţiate mai bine;
• dispunerea celulelor în monostrat facilitează o vizualizare bună a nucleilor;
• distribuţia antigenului este uniformă;
• rata diviziunii celulare este crescută astfel încât antigenele exprimate predominant în timpul mitozei  sunt uşor de localizat (de exemplu, pattern-ul de tip centromer).

Astfel, substratul Hep-2 permite recunoaşterea autoanticorpilor îndreptaţi împotriva antigenelor din toate etapele mitozei (profaza, metafaza, anafaza, telofaza), ceea ce nu este posibil utilizând substratul animal¹.

Cele mai importante aspecte nucleare descrise la examenul prin  imunofluorescenţă indirectă sunt:

• ASPECT NUCLEAR OMOGEN: fluorescenţa omogenă difuză a întregului nucleu în interfaza celulară; intensitatea fluorescenţei este mai pronunţată în regiunea cromozomială la celulele în mitoză; citoplasma este negativă. Apare asociat în principal cu lupusul eritematos sistemic (LES) comun şi lupusul indus medicamentos, dar mai poate să apară în artrita reumatoidă, artrita cronică juvenilă şi scleroza sistemică (alături de aspectul fin pătat). Antigenele implicate sunt: ADN dublu catenar (dsDNA), histone, Ku.
• ASPECTUL NUCLEAR OMOGEN INELAR: similar cu cel nuclear omogen, dar cu creşterea intensităţii fluorescenţei marginale nucleare în interfaza celulară; citoplasma este negativă. Este un aspect întâlnit comun în LES, mai ales în forma activă. Antigenul este reprezentat de dsDNA.
• ASPECT MATRICE NUCLEARA: fluorescenţa pătată ce dă naştere unei reţele nucleare spongioase în interfaza celulară. Acest aspect se poate întâlni în LES, boala mixtă de ţesut conjuctiv sau în boli cronice reumatice. Antigenele implicate sunt proteine ribonucleare heterogene (hnRNP).
• ASPECT PATAT FIN: fluorescenţa nucleară pătată cu aspect fin şi distribuţie uniformă în interfaza celulară. Apare în LES, sindromul Sjögren, sclerodermie, miozită şi boala mixtă de ţesut conjunctiv. Antigenele sunt reprezentate de  SS-A, SS-B, Ku, Ki şi Mi-2.
• ASPECT PATAT GROSIER: fluorescenţa nucleară pătată cu aspect grosier în interfaza celulară. Apare în LES, boala mixtă de ţesut conjunctiv, sindroame overlap, sindrom Raynaud şi psoriazis. Sunt implicate următoarele antigene: U1-snRNP sau Sm (proteine ribonucleare mici).
• ASPECT DE TIP CENTROMER: fluorescenţa nucleară pătată cu aspect fin în interfaza celulară; în cursul mitozei fluorescenţa este prezentă la nivelul cromozomilor. Apare în principal în sindromul CREST.
• ASPECT NUCLEOLAR OMOGEN: fluorescenţa omogenă a nucleolilor. Apare în sclerodermie, miozită,  sindrom overlap miozita-sclerodermie. Antigenul este constituit din complexul PM-Scl cu rol în biosinteza ribozomilor.
• ASPECT NUCLEOLAR PATAT: fluorescenţa pătată a nuclelolilor; în cursul mitozei fluorescenţa este prezentă la nivelul cromozomilor, cu două aspecte posibile: omogen (antigenul este reprezentat de Scl-70 – ADN topoizomeraza I) şi punctat (antigenele implicate sunt ARN polimeraza I şi NOR-90); este asociat cu sclerodermia.
• ASPECT NUCLEOLAR ”ÎN GRAMEZI” (”CLUMPY”):  fluorescenţa nucleolară în blocuri. Este întâlnit în sclerodermie; antigenul implicat este fibrilarina – o proteină alcalină asociată cu ribonucleoproteina nucleolară U3-snRNPs.
• ASPECT DE PUNCTE NUCLEARE: fluorescenţa punctiformă (aproximativ 10 puncte/nucleu) care apare în nucleoplasmă separat de nucleoli. Se asociază clinic cu: ciroza biliară primitivă, sindromul Sjögren, ocazional LES. Antigenele implicate includ complexe de multiproteine (Sp-100), cu rol insuficient cunoscut.
• ASPECT CENTRIOL/CENTROZOM: fluorescenţa sub formă de spoturi fine la cei 2 poli ce corespund fusului mitotic. Apare în sindromul Raynaud, mai rar în sclerodermie, sindromul Sjögren sau sindromul CREST. Antigenul este reprezentat de centrozom = sistem de microtubuli ce are rol în formarea fusului mitotic.
• ASPECT MEMBRANA NUCLEARA: fluorescenţa fină inelară a membranei nucleare cu scăderea intensităţii fluorescenţei în nucleoplasmă. Apare în hepatita cronică asociată sau nu cu vasculita, trombocitopenie şi LES. Antigenele implicate sunt polipeptide care furnizează situsuri de ancorare pentru cromozomi în interfaza celulară: laminine  A, B1, B2, C.
• ASPECT PCNA (PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN): fluorescenţa pătată variabilă (prezentă doar în unele celule) în interfaza celulară. Apare la 3-6% dintre pacienţii cu LES. Ca antigen este implicată ciclina, cu rol în replicarea şi repararea ADN-ului.

In figurile de mai jos sunt ilustrate câteva din pattern-urile nucleare descrise:

În concluzie, pattern-ul fluorescenţei nucleare reflectă specificitatea pentru diferite afecţiuni. Astfel, imunofluorescenţa indirectă permite diagnosticul primar în cazuri clinice incerte, monitorizarea tratamentului (prin titrul ANA) şi poate furniza informaţii decisive pentru investigaţiile ulterioare^1;2;5.

Pregătire pacient – à jeun (pe nemâncate) sau postprandial (după mese)³.

Specimen recoltat – sânge venos³. 

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant cu/fără gel separator³.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare³.

Volum probă – minim 0.5 mL ser³.

Cauze de respingere a probei – ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian³.

Stabilitate probă – serul separat este stabil 7 zile  la 4°C; timp mai îndelungat la -20 °C³.

Metodă – imunofluorescenţă indirectă³.

Valori de referinţă şi interpretarea rezultatelor

<1/80: Negativ³.

În unele cazuri, pe substratul Hep-2 se pot obţine diverse pattern-uri de fluorescenţă citoplasmatică:

–pătat fin, cu pete fluorescente dispersate, de dimensiuni mici, în majoritatea cazurilor pe un fond omogen sau pătat fin dens; antigenele sunt reprezentate de aminoacil-t-ARN-sintetaze, în special Jo-1; se asociază cu polimiozita/dermatomiozita;

–pătat fin dens, cu fluorescenţă granulară difuză, aproape omogenă, în întreaga citoplasmă; antigenele includ rRNP – fosfoproteine ribozomale; este întâlnit la pacienţii cu LES care prezintă manifestări SNC;

–polar, cu fluorescenţă perinucleară grosieră, cu granule dispuse în grămezi la un pol al celulei ce corespund lamelelor aparatului Golgi; se întâlneşte rareori în LES, în sindromul Sjögren, boala mixtă de ţesut conjunctiv, granulomatoza Wegener, infecţii virale (EBV, HIV);

–reticular grosier, cu fluorescenţă difuză reticulară şi granulară grosieră ce cuprinde aproape întreaga citoplasmă; antigenele sunt proteine din membrana internă a mitocondriilor (în special M2); se asociază cu ciroza biliară primitivă;

–reticular fin, cu fluorescenţă difuză reticulară şi granulară fină corespunzătoare reticulului endoplasmatic; se asociază cu afecţiuni hepatice cronice;

–fibrilar, cu o fluorescenţă lineară a fibrelor de stres din citoschelet; antigenele implicate sunt reprezentate de actină şi miozină; se întâlneşte în hepatita autoimună, ciroza biliară primitivă, boala mixtă de ţesut conjunctiv;

–segmentar, cu fluorescenţa unor segmente mici de fibre; antigenele sunt α-actinina, vinculina, tropomiozina; se asociază cu miastenia gravis, boala Crohn, colita ulceroasă.

În figurile de mai jos sunt ilustrate câteva din pattern-urile citoplasmatice descrise:

În toate aceste cazuri este necesară confirmarea rezultatului pe substraturi specifice sau determinarea prin metode imunoenzimatice².

Bibliografie