Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului
Neutrofilele deţin un rol important în răspunsul imun nespecific, în special în rezistenţa antibacteriană, ca celule efectoare, inductoare şi reglatoare. Printre caracteristicile lor esenţiale se numără:
Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenţa de receptori aflaţi la suprafaţa şi în interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi şi hormoni.
Chemotactismul neutrofilelor se produce ca răspuns la factorii chemotactici (chemotaxine) generaţi la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifică metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora şi acţiunile bactericide.
Fagocitoza este mediată de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele având receptori pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 şi pentru fragmentul complementului iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite şi opsonizate sunt distruse atât prin mecanisme oxigen-dependente cât şi oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen degradează bacteriile absorbite în fagozomi şi sunt parţial eliberaţi în mediul înconjurător unde intensifică distrugerea microorganismelor şi determină simultan lezarea ţesuturilor. Procesul este caracteristic inflamaţiei acute, fiind mult mai rar întâlnit în afecţiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce şi prin intermediul proteinelor prezente în granulaţiile azurofiele cum ar fi: catepsina G, lizozimul, interferonii etc.
Mediatorii inflamaţiei, citokinele (de exemplu, TNFα) şi selectinele cresc abilitatea granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamaţie. Capacitatea de fagocitoză este crescută prin intensificarea producţiei de radicali de oxigen şi prin eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenţează activitatea fagocitară şi citotoxică a neutrofilelor. La rândul lor, granulocitele activate secretă citokine; IL-1 care stimulează producţia de IL-8 de către monocite, celule endoteliale şi fibroblaşti, creşte expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 şi generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokină puternică care intensifică expresia receptorului Fc, stimulează modificările oxigenului precum şi eliberarea granulelor din neutrofile1.
Datorită caracteristicilor menţionate granulocitele sunt implicate în răspunsul inflamator precoce, iar anomaliile funcţionale ale acestora, survenite în oricare din etape, determină deficienţe semnificative ale imunităţii celulare5.
O activitate redusă sau absenţa de generare a exploziei oxidative în neutrofile sau monocite este întâlnită în unele defecte moştenite cum ar fi boala granulomatoasă cronică (CGD). CGD reprezintă un grup heterogen de afecţiuni cu transmitere X-linkată sau autozomal recesivă având la bază mutaţii genetice multiple. Ca urmare a acestor anomalii este afectată una din cele patru subunităţi ale enzimei NADPH oxidază ce catalizează formarea peroxidului de hidrogen. Procesul de fagocitoză se desfaşoară normal însă este perturbat metabolismul oxidativ – oxigenul molecular nu mai este redus la anionul superoxid şi la alţi radicali liberi (radical hidroxil şi peroxid de hidrogen) ce reprezintă componente importante ale mecanismului intracelular de distrugere a bacteriilor.
Pacienţii cu CGD prezintă infecţii recurente cu microorganisme producătoare de catalază, cum ar fi Staphylococcus aureus, care sunt capabili să distrugă peroxidul de oxigen generat de neutrofile. Aceste microorganisme supravieţuiesc ingestiei intracelulare, se multiplică şi determină o reacţie granulomatoasă din partea ţesuturilor, care atunci când devine excesivă poate obstrucţiona tracturile gastrointestinal şi genitourinar. Alte organe ce pot fi afectate de granuloame sunt plămânul, ganglionii limfatici, ficatul, osul. Infecţiile cronice cu Serratia spp., Klebsiella spp., Burkholderia cepacia şi Aspergillus spp., sunt în special problematice. De menţionat că pacienţii cu CGD nu suferă infecţii cu microorganisme catalazo-negative. Debutul bolii are loc de obicei în primii doi ani de viaţă2;3;4.
Explozia oxidativă a neutrofilelor poate fi afectată şi la pacienţii cu transplant precum şi la cei cu SIDA.
Anumite imunomodulatoare (citokine: GM-CSF, G-CSF, TNFα) pot avea un oarecare efect şi asupra metabolismului oxidativ celular4.
Caracteristica principală a neutrofilelor în CGD este aceea că după stimulare nu sunt capabile să producă o explozie oxidativă semnificativă. Metoda clasică pentru screening-ul acestei afecţiuni utilizează un colorant – albastru-nitrat de tetrazol (nitroblue tetrazolium – NTB test) ce este incubat împreună cu neutrofilele stimulate ale pacientului; neutrofilele funcţionale fagocitează, reduc şi precipită colorantul NTB galben rezultând depozite intracelulare de formazan negru-albastrui; aceste depozite reprezintă un indicator al formării intracelulare de peroxid de hidrogen; în urma examinării microscopice se efectuează un scor al neutrofilelor ce conţin depozite intracelulare de formazan3.
În laboratorul nostru testul NBT a fost înlocuit de Bursttest care foloseşte citometria în flux pentru a evalua metabolismul oxidativ alterat al neutrofilelor din CGD sau alte afecţiuni şi pentru a studia efectul unor medicamente imunomodulatoare4.
Pregătire pacient – se va evita recoltarea probei în cursul unei infecţii acute4.
Specimen recoltat – sânge venos4.
Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu4.
Volum probă – minim 10 mL sange heparinat4.
Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei4.
Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate4.
Metodă – citometrie în flux.
Bursttest permite evaluarea cantitativă a exploziei oxidative din neutrofile şi monocite. Se utilizează bacterii (E. coli) opsonizate nemarcate ca particule stimulante, ligandul de proteinkinaza C (PMA – forbol12-miristat 13-acetat) ca stimul puternic, independent de receptori şi peptidul chemotactic N-formil-MetLeuPhe (fMLP) ca stimul fiziologic slab. Sângele heparinat al pacientului este incubat cu stimulii menţionaţi la 37°C; se utilizează şi o probă cu rol de control negativ care nu este incubată cu stimuli; după stimulare, neutrofilele şi monocitele produc specii reactive de oxigen care distrug bacteriile din interiorul fagozomului; formarea acestor compuşi este monitorizată prin adăugarea unui substrat fluorogenic – dihidrorodamina (DHR) – care odată oxidat va genera produşi intracelulari fluorescenţi detectaţi ulterior prin citometrie în flux; reacţia este stopată prin adăugarea soluţiei de liză ce îndepărtează eritrocitele şi determină o fixare parţială a leucocitelor; soluţia de colorare a ADN-ului, adăugată înaintea analizei prin citometrie în flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au proprietăţi de dispersare a luminii asemănătoare leucocitelor; se utilizează un laser cu argon (488 nm, lumina albastră); pentru fiecare probă se colectează prin “gating” 10000-15000 leucocite; sunt analizate atât procentul de celule (neutrofile si monocite) care au produs specii reactive de oxigen (recrutare), cât şi intensitatea medie a fluorescenţei acestora (activitatea, cantitatea de substrat clivat); în acest scop se va efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant şi se va analiza histograma fluorescenţei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un marker pentru fluorescenţa-1 (FL1) astfel încât sub 1% din evenimente să fie pozitive; procentul de celule care produc specii reactive de oxigen va putea fi apoi determinat prin numărarea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a fluorescenţei se corelează cu numărul de produşi generaţi de către un singur leucocit4.
Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor
Sunt raportaţi următorii parametri:
- procentul de neutrofile care produce specii reactive de oxigen: >84%
- activitate oxidativă de neutrofile: >550 mfi; mfi = intenistatea medie a fluorescenţei4
Bibliografie
