Cariotip molecular (Hibridizarea genomică comparativă)

Ce este cariotipul molecular arrayCGH postnatal?

Cariotipul molecular arrayCGH este o analiză citogenetică moleculară care permite identificarea precisă și rapidă a unor anomalii cromozomiale neechilibrate asociate cu modificări ale numărului de copii ADN (microdeleții și microduplicații), care nu pot fi detectate prin analiza cromozomială clasică.

Metoda arrayCGH examinează întregul genom la o rezoluție superioară și poate explica un fenotip de 5-10 ori mai frecvent decât cariotipul clasic, având avantajul aplicabilității în situații în care cultura celulară nu este posibilă.

Fig.1 Acest exemplu ilustrează o deleție pe brațul lung al cromozomului 14 identificată prin metoda arrayCGH în laboratorul Synevo România

Laboratorul Synevo România utilizează platforma de microarray Agilent, care permite investigarea întregului genom la o rezoluție medie de detecție de 60Kb.

Ce presupune tehnica arrayCGH?

Tehnica arrayCGH se bazează pe hibridizarea genomică comparativă (CGH) a două tipuri de ADN genomic, proba de ADN a pacientului și proba de ADN de control, folosind lame array ce conțin zeci de mii de sonde care țintesc multiple gene și regiuni cromozomiale.

Fig.2 Principiul metodologiei arrayCGH

Tehnica arrayCGH permite identificarea CNV (copy number variants / variații ale numărului de copii ADN). Acestea se clasifică în 5 categorii: benigne, variații cu semnificație necunoscută (VOUS) posibil benigne, VOUS cu semnificație incertă, VOUS posibil patogenice și clar patogenice.

Aceste rearanjamente genomice submicroscopice sunt larg răspândite în întregul genom și reprezintă un factor important pentru evoluție, diferențiere fenotipică, dar și pentru susceptibilitate către anumite afecțiuni.

Legendă:

Roșu = pierdere de material genetic

Albastru = câștig de material genetic

Maro = rearanjament complex

Fig.3 Diferite tipuri de variații ale numărului de copii (CNV)

Câte tipuri de arrayCGH există?

Cariotipul molecular arrayCGH este utilizat atât în cercetare, cât și în diagnostic. Metodologic, acesta poate interoga nediscriminativ întregul genom, poate ținti un anumit număr de regiuni cu semnificație clinică aparte sau poate combina ambele metode.

În funcție de ceea ce conțin microcipurile de ADN fixate pe lamă, există microarray cu BAC (Bacterial Artificial Chromosome), cu oligonucleotide sau metoda particulară cu SNP (Single Nucleotide Polymorphisms). Fiecare metodă are particularitățile și aplicațiile sale.

Cariotipul molecular arrayCGH postnatal, efectuat în cadrul laboratorului Synevo România, presupune 60.000 de sonde reprezentate de oligonucleotide constituite din 60 de baze.

Care sunt indicațiile cariotipului molecular arrayCGH postnatal?

În diagnosticul postnatal, cariotipul molecular arrayCGH este test de primă intenție pentru:

• Pacienți cu malformații congenitale multiple / trăsături dismorfice neîncadrabile într-un sindrom genetic cunoscut
• Nou-născuți cu malformații congenitale multiple la care nu poate fi obținut cariotipul
• Copii cu întârziere în dezvoltarea psihomotorie
• Pacienți cu dizabilitate intelectuală
• Pacienți cu tulburări din spectru autist

Alte aplicații, cum ar fi retardul de creștere, întârzierea în achiziția limbajului sunt în curs de investigare.

Exemplu clinic din cazuistica Synevo România

 Trăsături fenotipice generale ale pacientului: dizabilitate intelectuală neexplicată, ușor dismorfism craniofacial, ochi situați mai adânc, sprâncene drepte, menton ascuțit.

Test utilizat pentru stabilirea diagnosticului: cariotip molecular arrayCGH.

Diagnostic: sindrom de microdeleție 1p36.

Care sunt avantajele metodei arrayCGH?

• Utilitate clinică crescută. Rata detecției de CNV patogenice la copiii cu retard de dezvoltare, dizabilitate intelectuală și anomalii congenitale multiple este de 18-20%, față de 3% prin cariotipul clasic. Ulterior, testarea altor membri ai familiei probanzilor afectați permite identificarea stării de purtător și caracterul moștenit sau de novo al anomaliei.
• Rezoluție medie de detecție de aproximativ 60kb. Oferă o perspectivă asupra întregului genom la o rezoluție înaltă, de 10 ori mai mare decât cea a cariotipului clasic.
• Un singur test arrayCGH este echivalentul simultan a mii de experimente FISH / MLPA.
• Detectează duplicații și deleții submicroscopice, rearanjamente cromozomiale neechilibrate, diferite grade de mozaicism.
• Nu necesită cultură celulară, precum cariotipul clasic.

Care sunt limitele metodei arrayCGH?

• Nu identifică modificări cromozomiale echilibrate (translocații, inversii, inserții), mutații punctiforme, mozaicismul de nivel scăzut. Aceste modificări sunt identificate prin alte teste genetice din portofoliul laboratorului Synevo România.
• Nu furnizează informații despre natura structurală a anomaliilor identificate.
• Poate detecta CNV cu semnificație neclară, care necesită testare și analize ulterioare sau CNV cu semnificație necunoscută, generând rezultate neinterpretabile în contextul cunoștințelor actuale.

Consultul genetic și consimțământul informat al pacientului sunt necesare în demersul stabilirii protocolului adecvat. Acestea presupun discutarea unor aspecte particulare despre posibile modificări cu relevanță clinică incertă sau predispoziții crescute către anumite boli cu debut la vârstă adultă.

Rolul medicului genetician este important, întrucât sfatul genetic înainte și după testare ajută pacientul să înțeleagă beneficiile și limitele metodei, precum și rezultatul testului.

Datele fenotipice ale pacientului sunt esențiale pentru interpretarea rezultatelor, iar colaborarea strânsă cu medicul trimițător contribuie la acuratețea diagnosticului și la îmbunătățirea managementului pacientului.

Specimen recoltat: 6 mL sânge venos.

Recipient de recoltare: vacutainer ce conține EDTA ca anticoagulant.

Cauze de respingere a probei: folosirea unui alt tip de anticoagulant; probe vechi, coagulate, hemolizate sau contaminate bacterian.

Stabilitate probă: maxim 72 ore din momentul recoltării probei până la intrarea acesteia în lucru.

Metodă: tehnica arrayCGH se bazează pe hibridizarea genomică comparativă (CGH) a două tipuri de ADN genomic, proba de ADN a pacientului și proba de ADN de control, folosind lame array ce conțin zeci de mii de sonde care țintesc multiple gene și regiuni cromozomiale.

Raportarea și interpretarea rezultatelor

Rezultatul cariotipului molecular arrayCGH descrie, conform ISCN (International System of Human Cytogenetic Nomenclature), modificările numerice și structurale neechilibrate identificate (pierdere sau câștig de material genetic), punctele de ruptură, dimensiunile exacte ale modificărilor.

În procesul interpretării se folosesc baze de date internaționale precum OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man), DECIPHER (Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources), DGV (Database of Genomic Variants), UCSC Genome Browser.

Interpretarea clinică finală a rezultatului se face de către medicul specialist genetician, în funcție de fenotipul pacientului și de conținutul în gene al regiunilor cromozomiale implicate în modificări.

Confirmarea testului se poate face, în funcție de situație, prin citogenetică clasică sau prin metode moleculare, precum FISH sau qPCR/MLPA.

Timp de răspuns: 12 – 20 zile

Descărcați formularul de consimțământ AICI.

Bibliografie:

• The Principles of Clinical Cytogenetics, Third Edition 2013, Steven L Gersen, Martin B. Keagle
• Analyzing Chromosomes, e-Library 2004, Barbara Czepulkowski.
• A Comprehensive Review in Clinical Cytogenetics, 2014, MD Anderson Cancer Center.
• ACMG Genetics and Genomics Review Course, 2013 edition.
• Cytogenetic abnormalities. Chromosomal, FISH and Microarray-Based Clinical Reporting, 2014 edition, Susan Mahler Zneimer.
• Laborator Synevo România. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate, 2015.