Determinarea factorului Rh

Informaţii generale

Antigenele sistemului de grup sanguin Rh sunt codificate de două gene: RHD şi RHCE localizate pe cromozomul 1. RHD codifică antigenul D, în timp ce RHCE codifică antigenele Cc şi Ee. Antigenul d nu există; totuşi, prin convenţie, d este utilizat pentru a conota absenţa antigenului D. RHD şi RHCE codifică polipeptide similare, care în membrana eritrocitară formează un complex cu glicoproteina asociată Rh. Funcţia antigenelor Rh nu este cunoscută, deşi pe baza fenotipului celulelor Rh nul este sugerat faptul că antigenele Rh ar juca un rol structural în membrana eritrocitară. Structura antigenelor Rh sugerează că sunt proteine de transport, iar glicoproteina asociată Rh ar putea juca un rol în transportul amoniacului. Există 45 antigene care au fost atribuite sistemului de grup sanguin Rh, dintre acestea cele mai comune şi importante fiind D, C, c, E şi e. Deşi indivizii pot deveni aloimunizaţi la antigenele C, c, E şi e prin transfuzii şi sarcină, acestea sunt mult mai puţin imunogenice decât D. Mai puţin de 3% din indivizii expuşi la antigenele C, c, E, e devin aloimunizaţi, astfel testarea pretransfuzională nu se efectuează de rutină pentru aceste antigene. După antigenele A şi B, antigenul D manifestă cea mai înaltă imunogenicitate (de 20 ori mai mare decât alte antigene Rh majore); în urma transfuziei de eritrocite D-pozitive aproape 80% din primitorii D-negativi dezvoltă anticorpi anti-D. În plus imunizarea anti-D promovează în continuare sinteza de anticorpi faţă de alte antigene de grup sanguin din sau din afara sistemului Rh⁵. De asemenea antigenul D este implicat în 95% din cazurile de boală hemolitică a nou-născutului¹.

Un individ este considerat Rh pozitiv dacă eritrocitele sale exprimă antigenul D, iar termenul Rh negativ se referă la absenţa antigenului D. Absenţa antigenului D este întâlnită al 15-17% din indivizii populaţiei albe şi este mai puţin frecventă în alte populaţii. La populaţia albă absenţa antigenului D se datorează deleţiei genei RHD, în timp ce la populaţia asiatică şi neagră se asociază mai degrabă cu inactivarea genei decât cu deleţia sa⁵.

Unele eritrocite care exprimă antigenul D necesită incubare prelungită cu reactivul anti-D pentru apariţia aglutinării. Aceste eritrocite sunt considerate antigen D pozitive şi sunt descrise ca D slab, anterior denumite D^u (în mai puţin de 1% din cazuri). Se consideră că fenotipul D slab apare prin unul din următoarele trei mecanisme⁵:

1. a) moştenirea unei gene RHD care codifică o proteină D cu expesie antigenică slăbită: este mai comună la populaţia neagră şi se asociază cu haplotipul Dce, iar la populaţia albă se asociază cu haplotipul DCe sau DcE.
2. b) interacţiunea genei D cu alte gene: indivizii cu gena D în poziţie trans faţă de gena C (ex.: Dce/Ce) prezintă o expresie slăbită a genei D.

Indivizii cu fenotip D slab prin unul din aceste două mecanisme nu formează aloanticorpi după expunerea la eritrocite D pozitive.

3. c) moştenirea unei gene care codifică un complex antigenic D căruia îi lipsesc unii epitopi, numit şi D parţial; aceşti indivizi pot produce anti-D dacă sunt transfuzaţi cu eritrocite D pozitive. Dintre aceştia D^VI prezintă numărul cel mai mic de epitopi şi aceste persoane prezintă cel mai mare risc de imunizare, dar semnificativ mai mic decât persoanele D negative³.

Donatorii cu D slab trebuie consideraţi Rh(D) pozitivi; este important ca aceştia să nu fie greşit etichetaţi ca Rh negativi, deoarece antigenul D slab poate induce un răspuns imun dacă este transfuzat la un individ Rh negativ^1;3;5. Indivizii cu D slab pot fi transfuzaţi cu sânge Rh pozitiv (excepţie D^VI), iar gravidele nu necesită profilaxie cu imunoglobulină anti-D^2;5. Dacă se utilizează un reactiv monoclonal anti-D adecvat, majoritatea determinanţilor antigenici încadraţi anterior ca D^u nu trebuie să mai fie deosebiţi de D în condiţii de rutină³.

Fenotipul Rh nul apare când eritrocitele nu exprimă antigene Rh, prin cel puţin două mecanisme posibile: moştenirea unei gene care codifică glicoproteina asociată Rh anormale, cu gene RHD şi RHCE normale, sau moştenirea unei mutaţii a genei RHCE asociată cu D negativ. Fenotipul Rh nul se asociază cu anomalii structurale eritrocitare cu stomatocitoză şi hemoliză. Aceşti indivizi formează aloanticorpi care interacţionează cu toate eritrocitele exceptându-le pe cele Rh nul⁵.

Anticorpii anti-Rh apar prin aloimunizare, în urma transfuziilor incompatibile în sistemul Rh sau în sarcină. Extrem de rar pot apărea anticorpi naturali în sistemul Rh, fără stimuli antigenici cunoscuţi (anti-E, anti-C^w), în majoritatea cazurilor irelevanţi din punct de vedere clinic^1;3. De asemenea în anemiile hemolitice imune autoanticorpii au adesea activitate anti-Rh¹.

Majoritatea anticorpilor anti-Rh sunt IgG, în special IgG₁ şi IgG₃ (aglutinine incomplete), deşi unii pot fi IgM, şi de obicei nu activează complementul⁵. Anticorpii aglutinanţi de tip IgM sunt de obicei tranzitorii şi apar la începutul imunizării¹. Cei mai comuni sunt anticorpii anti-D, care pot provoca boală hemolitică a nou-născutului şi reacţii transfuzionale hemolitice severe. Frecvenţa acestora a scăzut semnificativ o dată cu profilaxia anti-D la gravidele Rh negativ cu făt Rh pozitiv. Anticorpii anti-C, c, E, e se asociază cu boală hemolitică a nou-născutului şi reacţii hemolitice transfuzionale uşoare⁵.

Tiparea Rh a eritrocitelor se face cu seruri anti-D monoclonale care reacţionează în mediu salin şi care conţin atât IgM umane (care nu detectează categoria D^VI)³, cât şi anticorpi policlonali IgG, acestea din urmă putând fi utilizate şi în testul antiglobulinic pentru D slab². La prepararea serului anti-Rh se adaugă albumină umană sau bovină care modifică constanta dielectrică a mediului şi favorizează aglutinarea eritrocitelor Rh pozitive¹.

Recomandări pentru determinarea factorului Rh

• înaintea unei transfuzii;
• înaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potenţial asociate cu complicaţii hemoragice care ar putea necesita transfuzii;
• monitorizarea imunohematologică antepartum şi postnatală a mamei şi copilului;
• la donatorii de sânge.

În testarea de rutină a grupului sanguin nu se indică determinarea altor antigene Rh în afara factorului Rh D. Determinarea fenotipului Rh complet este indicată la donatorii de sânge, trebuie luată în considerare în cazul transfuziilor la fetiţe şi femei premenopauză, la pacienţi transfuzaţi cronic şi la primitorii cu anticorpi antieritrocitari iregulari³.

Pregătire pacient – nu este necesară o pregătire prealabilă; sunt utile informaţii asupra unor tratamente perfuzabile cu soluţii macromoleculare efectuate premergător determinării, transfuzii în ultimele 120 zile⁴.

Specimen recoltat – a) sânge capilar din pulpa degetului; b) sânge venos⁴.

Recipient de recoltare – b) vacutainer fără aditivi sau gel activator (capac roşu sau incolor); pentru metoda automată: vacutainer de 4 mL ce conţine EDTA (capac mov închis)⁴.

Cantitate recoltată – b) cât permite vacuumul⁴.

Cauze de respingere a probei – specimen puternic hemolizat⁴.

Stabilitate probă – testul se efectuează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, proba se păstrează 48 ore la 2-8°C; pentru metoda automată proba de sânge are o stabilitate de 7 zile la 2-8°C⁴.

Prelucrare necesară după recoltare – după coagularea completă la temperatura camerei se îndepărtează serul şi cheagul. Din hematiile rămase se prepară o suspensie 40% în plasma proprie sau în ser fiziologic. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepară o suspensie de 5% hematii în mediu special de suspensie^1;4. Pentru metoda automată proba de sânge va fi centrifugată în vederea obţinerii plasmei şi va fi introdusă în analizor (plasma va rămâne deasupra hematiilor)⁴.

Metodă de determinare – în laboratoarele Synevo se efectuează următoarele metode:

– hemaglutinare pe placă cu reactiv anti-D IgM monoclonal⁴. Determinarea se efectuează cu două tipuri diferite de anticorpi monoclonali, iar testarea include martorul autolog (martor albuminos – se testează eritrocitele pacientului cu mediul în care sunt conţinuţi Ac monoclonali), precum şi hematii martor de grup O, Rh pozitiv şi Rh negativ^1;3.                                      

– aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin un gel impregnat cu reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj ABO şi de determinare a Ag RH1( D) şi a Ag RH 1,2,3 ( DCE).

La fiecare rulare a probelor se utilizează un sânge de control de grup şi Rh cunoscute⁴.

– metoda automată de hemaglutinare pe plăci cu godeuri (în Laboratorul Central Synevo)

Plăcile de lucru (Erytype S) conţin 12 stripuri test cu câte 8 godeuri fiecare (1 strip = testare completă ABO şi factor Rh ). Pentru determinarea Rh se utilizează 2 seruri anti-D IgM monoclonale uscate ce căptuşesc două din godeurile stripului⁴.

Interpretarea rezultatelor

Pentru metoda de hemaglutinare pe placă

Primitori de sânge şi nou-născuţi:

• Rh(D) pozitiv dacă se obţin rezultate clar pozitive (>=2+) cu ambele seruri test anti-D, iar controlul auto este negativ;
• Rh(D) negativ dacă se obţin rezultate clar negative cu ambele seruri test anti-D, indiferent de rezultatul controlului auto.

Este obligatorie testarea suplimentară dacă se obţin rezultate slab pozitive (<=2+) sau discordante cu serurile test, iar controlul auto este negativ, precum şi dacă se obţin rezultate pozitive cu ambele seruri test, iar controlul auto este pozitiv³.

La donatori, dacă testul iniţial pentru D este negativ, trebuie efectuat un al doilea test care detectează D slab (acest lucru nu este necesar la primitorii de sânge, care trebuie transfuzaţi cu sânge Rh negativ)^1;2. De asemenea determinarea prezenţei D slab la femeia gravidă elimină tratamentul inutil cu imunoglobulină anti-D. Înaintea etichetării unui pacient ca D slab trebuie să ne asigurăm că nu a fost recent transfuzat cu eritrocite Rh pozitive².

Pentru metoda pe carduri

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de control este negativ. Reacţia pozitivă se apreciază în funcţie de dispersia aglutinatelor în microtub de la + la ++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ; – rezultat slab pozitiv ( + până la +++ ) ; – rezultat negativ ( – ).

Interpretarea rezultatului în microtubul RH1 (D)

Un rezultat pozitiv în microtubul RH1(D) indică prezenţa antigenului RH1(D) pe suprafaţa hematiilor investigate. Cardurile ABO/RH folosite în laborator nu permit detecţia tuturor antigenelor D slab imunogene şi nici fenotipul RH1 parţial categoria VI(D^VI)

Pentru aceste antigene particulare trebuie să se execute teste suplimentare.

Interpretarea rezultatului în microtubul RH1,2,3 (DCE)

Un rezultat pozitiv în tubul RH1,2,3(DCE) indică prezenţa antigenului RH1 (D) şi/sau RH2 (C) şi/sau RH3 (E) la suprafaţa hematiilor de testat⁴.

Pentru metoda automată

După ce a avut loc reacţia de aglutinare fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat automat de către analizor, rezultatele fiind interpretate astfel:

• Reacţie pozitivă – prezenţa aglutinării (intensitatea este apreciată de la 1+ – 4+)
• Reacţie negativă – absenţa aglutinarii
• Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic

Toate imaginile şi rezultatele obţinute sunt verificate şi validate de către medic⁴.

Limite şi interferenţe

Reacţii fals pozitive (martor albuminos pozitiv)¹

• hematii în fişicuri/rulouri (mielom, macroglobulinemie Waldenström) – se reface determinarea după spălarea hematiilor;
• poliaglutinarea;
• anemii hemolitice cu autoanticorpi la cald (prezenţa de anticorpi IgG pe suprafaţa hematiilor) – se reface grupajul cu un reactiv din care se elimină albumina, care conţine Ac anti-D aglutinanţi capabili să aglutineze hematiile în suspensie salină (anti-D salin).

Reacţii fals negative

• anemia hemolitică a nou-născutului (blocarea situsurilor antigenice D de către anticorpii materni)¹;
• individ cu Rh D slab – posibilă aglutinare slabă şi tardivă; aceste cazuri se îndrumă către un serviciu de specialitate, unde determinarea D slab se face cu ajutorul testului antiglobulinic indirect cu anti-D IgG (incompleţi policlonali)^1;3.

Bibliografie