Informaţii generale
La om au fost identificate 26 sisteme de grup sanguin cu 228 antigene; un sistem de grup sanguin constă din unul sau mai multe antigene guvernate de o singură genă sau de un complex de două sau mai multe gene strâns legate între ele. De asemenea au fost identificate şi alte antigene care nu au fost atribuite sistemelor stabilite. Antigenele eritrocitare pot fi proteine, glicoproteine sau glicolipide. Majoritatea sunt sintetizate de eritrocit, totuşi unele antigene, cum ar fi cele aparţinând sistemului Lewis, sunt adsorbite din plasmă pe membrana eritrocitară. Unele antigene sunt specifice eritrocitelor, în timp ce altele sunt întâlnite şi pe alte celule din organism. Cunoaşterea grupelor sanguine este esenţială pentru terapia transfuzională. Astfel indivizii care nu prezintă anumite antigene eritrocitare pot produce aloanticorpi atunci când sunt expuşi la sânge care conţine aceste antigene în transfuziile cu produse de sânge sau în timpul sarcinii. Anticorpii care interacţionează cu antigenele eritrocitare produc reacţii transfuzionale hemolitice imediate sau întârziate şi boala hemolitică a nou-născutului4.
Sistemul de grup sanguin ABO reprezintă cel mai important sistem de grup sanguin deoarece: când antigenele nu sunt exprimate pe suprafaţa eritrocitelor, anticorpii corespunzători sunt întotdeauna prezenţi în plasmă, stimulii pentru producţia de anticorpi fiind reprezentaţi de o varietate de factori de mediu, cum ar fi bacteriile (ex.: E. coli), care exprimă pe suprafaţă structuri aproape identice carbohidraţilor ABO; anticorpii formaţi reprezintă un amestec de IgM (predominant) şi IgG, activi la 37ºC şi capabili să activeze complementul, iar densitatea mare de situsuri antigenice de pe membrana eritrocitară permite legarea unui număr mare de anticorpi ducând, în cazul transfuzării de sânge incompatibil în sistemul ABO, la reacţii transfuzionale hemolitice acute2;4.
Există trei gene alele în sistemul ABO (A, B şi O) cu transmitere mendeliană; A şi B sunt alele codominante, iar O este o alelă recesivă. Aceste trei gene determină patru fenotipuri: A, B, AB şi O, indivizii cu fenotip A sau B putând fi heterozigoţi (AO, respectiv BO) sau homozigoţi (AA, respectiv BB). Antigenele sistemului ABO sunt localizate pe lanţuri oligozaharidice care fac parte din glicosfingolipide. Genele sistemului ABO nu codifică direct antigenele, ci enzime care adaugă zaharuri specifice la un substrat din membrana eritrocitară (substanţa H): N-acetil-galactozamină pentru gena A şi galactoză pentru gena B; alela O codifică o transferază nonfuncţională, astfel că nici un zahar specific nu este ataşat membranei eritrocitare. Gena H codifică o fucozil-transferază care adaugă grupări de L-fucoză la galactoza terminală a lanţurilor oligozaharidice, rezultând substanţa H. O alelă rară moştenită uneori în locusul H este h, care codifică o transferază nonfuncţională. La homozigoţii hh (fenotipul Bombay) substanţa H nu este prezentă pe suprafaţa eritrocitelor, iar transferazele A şi B, chiar dacă sunt prezente, nu pot adăuga zaharurile specifice care determină specificitatea antigenică A sau B. Relevanţa clinică a fenotipului Bombay este capacitatea acestor indivizi de a forma nu numai anti-A şi anti-B, dar şi anti-H, ceea ce face dificilă găsirea de sânge compatibil pentru transfuzii, numai sângele de la un individ cu fenotip Bombay fiind compatibil, iar acesta este extrem de rar. Mutaţii ale genelor A şi B rezultă în substituţii de aminoacizi la nivelul transferazelor, care se traduc în expresia slabă a antigenelor A şi B, clasificate ca subgrupe, cele mai comune fiind asociate cu gena A, A1 şi A2. Subgrupele A şi B sunt relevante clinic la donatorii de sânge, deoarece, datorită expresiei slabe a antigenului, pot fi fenotipate ca aparţinând grupului O şi, transfuzate la un primitor cu grup O, pot duce la hemoliză intravasculară2;4.
Toţi indivizii imunocompetenţi produc anticorpi naturali (izoaglutinine sau izohemolizine) faţă de antigenele de grup ABO(H) lipsă. Anti-A şi anti-B sunt de obicei detectabili la 3-6 luni după naştere, iar la vârsta de 5 ani titrul anticorpilor atinge maximul şi se menţine în toată perioada adultă. Titrul anticorpilor IgM poate scădea gradual cu vârsta avansată. Anticorpii anti-A şi anti-B sunt prezenţi şi la cei cu variante A sau B slabe. Nou-născuţii nu au de obicei o cantitate semnificativă de anti-A şi anti-B în plasmă, cu excepţia celor născuţi din mame aloimunizate, la care pot fi prezenţi în circulaţie anticorpi IgG de la mamă care au traversat placenta. Anticorpii ABO nu reprezintă o cauză majoră de boală hemolitică a nou-născutului datorită inhibiţiei anticorpilor de substanţele A şi/sau B solubile prezente în sânge precum şi antigenelor A sau B prezente pe alte celule în afara eritrocitelor; de asemenea afinitatea de legare a anticorpilor faţă de molecule de zaharuri este mai slabă decât cea a anticorpilor faţă de molecule proteice, cum ar fi antigenul D4. Hemoliza apare mai probabil dacă mama este grup O, cu copil grup A2.
Recomandări pentru determinarea grupului sanguin ABO2
- înaintea unei transfuzii;
- înaintea unei proceduri invazive sau chirurgicale potenţial asociate cu complicaţii hemoragice care ar putea necesita transfuzii;
- monitorizarea imunohematologică antepartum şi postnatală a mamei şi copilului;
- la donatorii de sânge;
- pentru compatibilitatea de grup ABO în transplantul de rinichi şi inimă.
Pregătire pacient – nu este necesară o pregătire prealabilă; sunt utile informaţii asupra unor tratamente perfuzabile cu soluţii macromoleculare efectuate premergător determinării, transfuzii în ultimele 120 zile, boli infecţioase cu germeni Gram negativi cu/fără septicemie, boli maligne (carcinom, limfom, mielom)3.
Specimen recoltat – a) sânge capilar din pulpa degetului; b) sânge venos3.
Recipient de recoltare – b) vacutainer fără aditivi sau gel activator (capac roşu sau incolor); pentru metoda automată: vacutainer de 4 mL ce conţine EDTA (capac mov închis)3.
Cantitate recoltată – b) cât permite vacuumul3.
Cauze de respingere a probei – specimen puternic hemolizat3.
Stabilitate probă – testul se efectuează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, proba se păstrează 48 ore la 2-8°C; pentru metoda automată proba de sânge are o stabilitate de 7 zile la 2-8°C3.
Prelucrare necesară după recoltare – după coagularea completă la temperatura camerei se îndepărtează serul şi cheagul. Din hematiile rămase se prepară o suspensie 10% în plasma proprie sau în ser fiziologic1;3. Pentru metoda de aglutinare pe carduri se prepară o suspensie de 5% hematii în mediu special de suspensie. Pentru metoda automată proba de sânge va fi centrifugată în vederea obţinerii plasmei şi va fi introdusă în analizor (plasma va rămâne deasupra hematiilor)3.
Metode de determinare – în laboratoarele Synevo se efectuează:
a. metoda directă/globulară (Beth-Vincent) de determinare a grupului sanguin ABO utilizând seruri anti-A, anti-B şi anti-AB, cu următoarele variante:
– hemaglutinare pe placă3. Se utilizează doi martori: martor AB (hematiile pacientului cu ser AB) şi martor auto (hematiile şi serul propriu)1.
– aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin un gel impregnat cu reactivul specific antigenului eritrocitar de determinat (anticorpi monoclonali murini sau umani) – test direct de grupaj ABO şi de determinare a Ag RH1( D) şi a Ag RH 1,2,3 ( DCE).
Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de control este negativ. Reactia pozitivă se apreciază în funcţie de mărimea aglutinatelor de la + la ++++.
La fiecare rulare a probelor se utilizează un sânge de control de grup şi Rh cunoscute3.
b. metoda automată de hemaglutinare pe plăci cu godeuri (în Laboratorul Central Synevo)
Plăcile de lucru (Erytype S) conţin 12 stripuri test cu câte 8 godeuri fiecare (1 strip = testare completă ABO şi factor Rh ).
Grupul sanguin se va determina atât prin metoda directă, globulară (Beth – Vincent) ce pune în evidenţă antigenele eritrocitare cu ajutorul serurilor test (seruri monoclonale uscate, ce căptuşesc o parte din godeurile de reacţie), cât şi prin metoda indirectă, plasmatică (Simonin), ce evidenţiază anticorpii din plasma analizată cu ajutorul eritrocitelor test, aglutinarea având loc în godeurile necăptuşite ale stripului de lucru. Un godeu de pe strip include controlul negativ al reacţiei.
Reacţia de aglutinare a hematiilor în metoda directă este potenţată de utilizarea bromelinei (enzimă proteolitică ce clivează lanţurile polipeptidice de la suprafaţa hematiilor, reducând astfel sarcina negativă a celulelor; prin urmare va creşte forţa de atracţie între hematii în prezenţa anticorpului corespunzător).
În etapa finală, fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat automat de către analizor, rezultatele fiind interpretate astfel:
- Reacţie pozitivă – prezenţa aglutinării ( intensitatea este apreciată de la 1+ – 4+ )
- Reacţie negativă – absenţa aglutinării
- Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic
Toate imaginile şi rezultatele obţinute sunt verificate şi validate de către medic3.
Limite şi interferenţe
Rezultatul determinării grupului de sânge trebuie citit de două persoane şi trebuie eventual confirmat pe o a doua probă de sânge1;2.
Erori de citire datorate greşelilor de tehnică:
– sticlărie murdară; contaminare bacteriană;
– prezenţa de microcheaguri (falsă aglutinare);
– nu se respectă: proporţiile hematii/ser, ordinea de picurare a serurilor hemotest (aglutinări contradictorii), timpul de citire – citire tardivă: margini uscate (falsă aglutinare), citire precoce (lipsa aglutinării sau aglutinare slabă).
Erori datorate hematiilor
False aglutinări
a) Prezenţa rulourilor (pseudoaglutinarea): utilizarea de soluţii macromoleculare (Dextran, HES), tulburări de coagulare, probe de sânge incomplet coagulate, hiperfibrinogenemia, produşi de degradare a fibrinei, agenţi fibrinolitici, disproteinemia, paraproteinemia, crioglobulinemia, creşterea reactanţilor de fază acută, medicamente (doze mari de heparină, sulfat de protamină), factori reumatoizi, creşterea colesterolului, bilirubinei, leucocitoza, enzime leucocitare2. Martorul AB este pozitiv; spălarea hematiilor permite efectuarea corectă a probei globulare1.
b) Autoaglutinarea
- Prezenţa de aglutinine la rece (martorul auto este pozitiv). Proba de sânge şi reactivii se preincubează la 37ºC, iar testarea se efectuează la cald2.
- Hematii acoperite de aloanticorpi: nou-născut din sarcină incompatibilă (în sistemul Rh, ABO), pacient transfuzat cu sânge incompatibil.
- Determinarea grupului sanguin pe sânge recoltat din cordonul ombilical: gelatina Wharton, substanţă macromoleculară care înconjoară eritrocitele, dă aspect de pseudoaglutinate. Pentru îndepărtarea ei este necesară spălarea hematiilor de cel puţin 6 ori înaintea determinării1.
- Prezenţa complexelor imune medicamentoase.
c) Poliaglutinarea
-
În septicemiile cu bacilli Gram negativi sunt expuse criptoantigene (T), prin acţiunea enzimatică a agenţilor bacterieni, recunoscute de anticorpi (anti-T) prezenţi în majoritatea serurilor umane2. Martorul AB este pozitiv1.
Aglutinări absente sau slabe sau aspect de dublă populaţie: aglutinarea nu este totală, cu prezenţa de hematii libere (aglutinatele apar pe un fond roz)1;2:
- sânge vechi;
- antigene slabe: nou-născuţi, prematuri;
- subgrupe A sau B slabe;
- atenuarea antigelor (în leucemii, limfoame, boală Hodgkin);
- pacient cu grup A sau B transfuzat cu sânge grup O, hemoragie materno-fetală;
- prezenţa în cantitate mare de substanţă A sau B în plasmă (cancer de stomac, pancreas) care neutralizează anticorpii test (hematiile trebuie spălate pentru îndepărtarea acestora);
- prezenţa unei chimere sau mozaic (excepţional, ex.: post-alotransplant medular).
Bibliografie
