HE4 (Proteina epididimală umană 4)

Informații generale și recomandări pentru efectuarea HE4

Proteina epididimală umană 4 (HE4) face parte din familia proteinelor acide din zer al căror miez conține 4 legături disulfidice (WFDC= whey acidic four-disulfide core) și care prezintă proprietăți inhibitorii asupra tripsinei. Atât substratul cât și funcția HE4 sunt necunoscute; proteina constituie probabil un agent antimicrobian și antiinflamator.

Gena corespunzătoare HE4 este localizată pe cromozomul 20q12-13.1 și codifică o proteină de 13 kD; în forma sa matură glicozilată proteina are o greutate moleculară de aproximativ 20-25 kD și este alcătuită dintr-un singur lanț peptidic ce conține două domenii WFDC (din acest motiv este denumită și WFDC2).

Proteina a fost identificată inițial în celulele epiteliale ale epididimului distal uman și considerată a fi specifică acestuia, fiind asociată cu fertilitatea (HE4 = Homo sapiens epididymis specific). Ulterior s-a constatat că HE4 se exprimă în cantități reduse la nivelul epiteliului normal din anumite țesuturi: tract reproductiv (inclusiv ovar), căi respiratorii superioare și pancreas. Expresia sa devine însă semnificativ crescută  la nivelul unor linii celulare provenite din tumori de ovar, plămân, colon și sân. Un număr de studii moleculare independente au arătat că gena WFDC2 este exprimată în exces la pacientele cu cancer ovarian în comparație cu persoanele sănătoase^1;2;3. Prin studii de imunohistochimie Drapkin și colaboratorii au arătat că expresia HE4 este limitată la anumite subtipuri histologice de cancer ovarian epitelial. Astfel, HE4 a fost identificat în 93% dintre tumorile seroase, în toate cazurile de adenocarcinom endometrioid, în numai 50% din adenocarcinoamele cu celule clare și deloc în tumorile mucinoase⁴.

În 2003 Hellström și colaboratorii săi au arătat că proteina HE4 este detectată în cantități mari în serul pacientelor cu cancer ovarian. Din acest motiv, s-a considerat că HE4 ar putea constitui un biomarker util pentru estimarea riscului de cancer ovarian¹.

Cancerul ovarian reprezintă o problemă majoră de sănătate pentru sexul feminin, având o morbiditate și mortalitate ridicate. Astfel, peste 200 000 femei din întreaga lume sunt diagnosticate anual cu acest tip de neoplazie, cea mai mare incidență fiind înregistrată în SUA și Europa de Nord și cea mai mică în Africa și Asia. În România sunt raportate 9.4 cazuri la 100 000 locuitori. Cancerul ovarian reprezintă cea de-a 4-a cauza de deces prin cancer la femei fiind responsabil de 5% dintre aceste decese. Conform datelor furnizate de International Agency for Research in Cancer rata medie de supraviețuire la 5 ani a pacientelor cu cancer ovarian este 46%; această rată se îmbunătățeste dramatic (până la 94%) în situațiile în care afecțiunea este diagnosticată în stadiul I de boală cand tumora este limitată la unul sau ambele ovare. Din păcate, în 70-75% din cazuri tumorile se depistează într-un stadiu avansat, cel mai adesea în urma unei intervenții chirurgicale pentru o masă pelvină. Cele mai multe tumori ovariene sunt de origine epitelială (aproximativ 90%), iar dintre acestea 50% constituie adenocarcinoame seroase (atât solide cât și chistice), 36% adenocarcinoame mucinoase (chisturi care conțin un lichid mucinos), iar restul este reprezentat de adenocarcinoamele endometrioide (chisturi care conțin un lichid maroniu) și de adenocarcinoamele cu celule clare (chisturi care conțin un lichid clar)^3;5.

Există mai mulți factori care contribuie la diagnosticul în stadiu avansat al cancerului ovarian. În primul rând lipsa de specificitate a simptomelor (durere sau presiune pelvină, indigestie persistentă și meteorism abdominal, micțiuni imperioase) întârzie prezentarea pacientelor la un consult medical, iar atunci când acestea ajung la un medic acesta nu recunoaște adesea implicațiile unor astfel de simptome. Pe de altă parte nu există o investigație neinvazivă care să aibă o acuratețe suficient de mare pentru a distinge între o masă pelvină benignă și una malignă. De obicei pacientele sunt evaluate printr-un examen pelvin și ecografie transvaginală (metoda imagistică primară pentru confirmarea originii ovariene a masei), iar apoi sunt supuse chirurgiei exploratorii și examenului histopatologic. Tratamentul standard pentru cancerul ovarian epitelial constă în stadializare și citoreducție chirurgicală primară urmată de chimioterapie în majoritatea cazurilor.

Pe lângă investigațiile și procedurile menționate a fost acordat un interes deosebit pentru identificarea unor biomarkeri care să fie utili în managementul pacientelor cu cancer ovarian. În mod curent, cel mai utilizat biomarker este antigenul tumoral CA 125. Astfel, femeile ce se prezintă cu formațiune tumorală pelvină sunt testate adesea pentru CA 125 împreună cu ecografia transvaginală. Deși nivelurile serice crescute ale marker-ului sunt strâns corelate cu cancerul ovarian epitelial (creșteri sunt înregistrate în 80% din cazuri), valori ridicate pot fi întâlnite și în condiții benigne cum ar fi endometrioza, insuficiența cardiacă congestivă, ciroza hepatică, limitându-i astfel specificitatea. Mai mult, nivelurile CA 125 sunt mai mari la femeile în perioada de premenopauză ceea ce crește incidența rezultatelor fals-pozitive la această categorie de paciente. Pe de altă parte antigenul CA 125 are o sensibilitate de numai 50% pentru stadiul I de boală, având astfel o utilitate scăzută pentru depistarea precoce a cancerului ovarian. După administrarea tratamentului determinările seriate de CA 125 pot fi utilizate pentru detectarea recurențelor bolii^3;5;6.

Un alt marker seric aprobat recent – iunie 2008 – de către FDA pentru monitorizarea pacientelor cu cancer ovarian epitelial în asociere cu alte metode clinice este HE4. Eficacitatea acestui marker ca instrument de monitorizare a evoluției bolii a fost dovedită prin evaluarea modificărilor nivelurilor serice HE4 în probe seriate provenite de la 80 paciente cu cancer ovarian comparativ cu schimbările survenite în statusul bolii. Acest studiu a indicat că nivelurile seriate HE4 s-au corelat cu statusul clinic (progresie vs absența progresiei) la 70% din probele analizate. In plus, s-a stabilit ca HE4 este practic echivalent cu antigenul CA 125 în ceea ce privește detectarea recurențelor bolii, însă prezintă avantajul că nivelurile sale serice sunt mult mai puțin influențate de condiții benigne⁷.

Posibilitatea ca HE4 sa fie utilizat și ca instrument de diagnostic este susținută de studii recente care au evaluat mai mulți biomarkeri ai cancerului ovarian. Astfel, Huhtinen și grupul său de lucru au raportat pentru HE4 o sensibilitate de 78.6% la o specificitate de 95% în diferențierea tumorilor ovariene maligne de chisturile ovariene endometriozice⁸. Moore și colaboratorii au constatat că dintre cei 9 biomarkeri analizați în studiu, HE4 prezintă eficacitatea cea mai mare în detectarea cancerului ovarian epitelial, având o sensibilitate mai bună decât CA 125 – marker-ul „gold standard” pentru această afecțiune (72.9% vs. 43.3% la o specificitate de 95%). Ceea ce au dorit să scoată în evidență acești cercetatori este faptul că sensibilitatea HE4 este net superioară în stadiul I de boală (45.9% la o specificitate de 95%), situație în care  determinarea izolată de CA125 este lipsită de importanță. De asemenea HE4 are o sensibilitate mai mare decât CA 125 la femeile premenopauză. Dacă se iau în considerare toate stadiile bolii, utilizarea combinată a antigenului Ca 125 cu HE4 furnizează sensibilitatea cea mai mare în identificarea afecțiunii maligne (76.4% la o specificitate de 95%)³.

Pentru estimarea riscului de cancer ovarian epitelial a fost dezvoltat un algoritm – ROMA (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm) – ce ia în considerare valorile preoperatorii de HE4 și CA 125 precum și statusul de pre- sau postmenopauză. Algoritmul calculează probabilitatea de a depista un proces ovarian malign la intervenția chirurgicală pentru o masă pelvină. In studiul efectuat, Moore și colaboratorii au constatat că la o specificitate de 75% algoritmul ROMA prezintă o sensibilitate de 94.3% în diferențierea statusului benign de cancerul ovarian epitelial în toate stadiile de boală; pentru stadiile I și II de boală ROMA a demonstrat o sensibilitate de 85.3%. Algoritmul ROMA s-a dovedit a fi mai sensibil decât indicele riscului de malignitate (RMI = Risk of Malignancy Index) care ia în calcul rezultatele ecografiei transvaginale, statusul de pre- sau postmenopauza și nivelurile serice de CA 125⁹.

Conform unor date publicate în aprilie 2011 testul HE4 și algoritmul ROMA au fost validate pentru diferențierea maselor pelvine beningne de cele maligne și în populația italiană¹⁰.

În septembrie 2011 FDA a aprobat utilizarea combinată a celor 2 markeri și a algoritmului ROMA în stabilirea riscului de cancer ovarian la femeile pre- și postmenopauză ce prezintă o masă pelvină¹¹.

Într-un mod asemănător cancerului ovarian, neoplaziile endometrului tind să aibă un prognostic favorabil atunci când sunt depistate în stadii precoce. Datorită simptomatologiei particulare (metroragiii postmenopauza) diagnosticul se stabilește într-un stadiu precoce de boală în aproximativ 70% din cazuri. Cu toate acestea, pentru restul de 30% precum și pentru alte categorii de paciente cu risc crescut (sindrom al  cancerului de colon non-polipozic ereditar, sindrom Cowden, obezitate, diabet zaharat, cancer mamar sub tratament cu tamoxifen) ar fi necesar un marker non-nvaziv care să ajute la diagnosticul precoce. În plus, unele paciente cu cancer de endometru în stadiul I prezintă factori de risc suplimentari legați de gradul de invazie al tumorii și afectarea limfovasculară; și la acestea ar fi necesar un biomarker relevant de monitorizare a bolii. CA 125 are valoare limitată pentru monitorizarea recurențelor bolii deoarece numai 10-20% din pacientele având stadiul I și 25% din cele cu recurențe asimptomatice vor prezenta valori crescute ale acestui antigen tumoral. Într-un studiu recent condus de Moore și colaboratorii săi s-a constatat că HE4 a avut ca marker izolat acuratețea cea mai mare de detecție a cancerului endometrial (sensibilitate de 48.4%, 71.4% și 55% la o specificitate de 90% pentru stadiile I, II-IV și respectiv pentru toate stadiile). Combinarea HE4 cu CA 125 a dus la creșterea sensibilității detectării în comparație cu folosirea doar a antigenului CA 125 (50.1 vs 24.6% la o specificitate de 95%) și cu utilizarea doar a marker-ului HE4 pentru stadiile II-IV de boală (86.6 vs 83.6%); asocierea nu a avut un impact asupra sensibilității în comparație cu HE4 izolat la pacientele în stadiul I sau atunci când s-au luat în considerare toate stadiile⁶.

 În concluzie, determinarea HE4 prezintă următoarele indicații clinice:

•  monitorizarea evoluției bolii și a recurențelor la pacientele având cancer ovarian epitelial;
•  împreună cu CA 125, estimarea riscului de cancer ovarian epitelial la femeile pre-menopauză și post-menopauză care prezintă masa pelvină.

HE 4 ar putea constitui și un biomarker pentru cancerul endometrial însă sunt necesare studii suplimentare⁵.

Pregătire pacient – nu este necesară o pregătire specială; se va preciza obligatoriu pe biletul de trimitere statusul de pre- sau postmenopauză⁵.

Specimen recoltat – sânge venos⁵.

Recipient de recoltare – vacutainer fără anticoagulant, cu/fără gel separator⁵.

Prelucrare necesară după recoltare – se separă serul prin centrifugare; se lucrează serul proaspăt în maxim 5 ore; dacă acest lucru nu este posibil, serul se păstrează 48 ore la 2-8°C după care se congelează la -20°C⁵.

Volum probă – minim 0.5 mL ser⁵.

Cauze de respingere a probei

Stabilitate probă – serul este stabil 2 zile la 2-8°C; 3 luni la -20°C; probele pot fi congelate de 2 ori⁵.

Metodă – imunochimică cu detecție prin electrochemilumiscență (ECLIA)³. Testul este standardizat conform primului test HE4 disponibil de la Fujirebio Diagnostics, Inc⁵.

Limita de detecție – 15 pmol/L; limita de cuantificare 20 pmol/L la o eroare totală de 30%⁵.

Valori de referință și interpretarea rezultatelor

< 40 ani: < 60.5 (pmol/L)
40 – 49 ani: < 76.2 (pmol/L)
50 – 59 ani: < 74.3 (pmol/L)
60 – 69 ani: < 82.9 (pmol/L)
> 70 ani: < 104 (pmol/L)

La femeile cu masa pelvină la care s-au determinat nivelurile preoperatorii de HE și CA 125 se poate calcula scorul ROMA astfel:

– mai întâi se calculează indicele predictiv (Predictive Index, PI) separat pentru pacientele în perioada pre- și postmenopauză cu ajutorul ecuațiilor:

Premenopauză:

       PI = -12,0 + 2,38*LN[HE4] +0,0626 x LN[CA125]

Postmenopauză:

       PI = – 8,09 + 1,04 x LN[HE4] + 0,732 x LN[CA125]

       LN = logaritm natural

-scorul ROMA se calculează din IP folosind ecuația:

ROMA (%) = exp(PI) /[1+exp(PI)] x 100

Exp(PI) = e^PI

În urma unui studiu s-au stabilit următoarele valori cut-off la o specificitate de 75% pentru combinația de teste HE4 și CA 125 efectuate prin metoda ECLIA pentru a se face o stratificare a pacientelor în grupuri cu risc crescut sau scăzut pe baza scorului ROMA:

Femei premenopauză:

Femei postmenopauză:

Conform studiului, 84.3% dintre pacientele cu cancer ovarian epitelial în stadiile I-IV au fost încadrate corect în grupul cu risc crescut pe baza scorului ROMA, iar 75.6% dintre femeile cu masă pelvină benignă au fost clasificate în grupul risc cu scăzut.

În cazul în care HE4 este utilizat în dinamică la pacientele cu cancer ovarian epitelial sunt considerate clinic semnificative modificarile nivelului seric ≥ 20% atât în sensul creșterii (recurența, progresie a bolii) cât și în sensul reducerii acestuia (răspuns terapeutic)⁵.

Limite și interferențe

Valorile HE4 trebuie interpretate întotdeauna în contextul clinic al pacientelor; HE4 nu reprezintă un test de screening al cancerului.

HE4 poate înregistra uneori valori crescute și în afecțiuni benigne.

HE4 nu trebuie utilizat în monitorizarea pacientelor cu tumori ovariene de tip adenocarcinom mucinos sau cu celule germinale.

Algoritmul ROMA nu a fost validat pentru următoarele grupe de paciente:

ROMA nu reprezintă un test diagnostic ci un instrument de stratificare a pacientelor cu masă pelvină în grupul cu risc scăzut sau crescut de depistare a cancerului ovarian epitelial la intervenția chirurgicală⁵.

Deși este considerat un marker mult mai specific pentru cancerul ovarian epitelial comparativ cu CA125, recent au fost identificați pentru HE4 unii factori de variație de care trebuie ținut cont la interpretarea rezultatelor obținute:

• vârsta: între nivelul seric HE4 și vârstă există o relație non-lineară complexă; astfel, s-a raportat o tendință de creștere a valorilor HE4 cu fiecare decadă de viață (de exemplu, la 60 ani valorile HE4 la persoanele sănătoase sunt cu 37% mai mari comparativ cu cele de la 20-30 ani);
• fumatul: influențează semnificativ nivelul HE4 (prin supraexpresie la nivelul epiteliului bronșic)¹²;
• afecțiunile renale: reprezintă cea mai frecventă cauză de valori HE4 fals crescute; a fost raportată o relație lineară între nivelul seric HE4 și rata estimată a filtrării glomerulare (eGFR); spre deosebire de CA125 care înregistrează valori crescute în stadiul avansat de boală renală cronică, HE4 prezintă creșteri încă din stadiile timpurii de boală; astfel dacă valorile HE4 peste limita superioară a intervalului de referință se asociază cu eGFR < 48 ml/min/1.73 m², se vor lua în considerare concentrațiile serice CA125 pentru stabilirea riscului de cancer ovarian^12;13.

Deoarece un grad de afectare renală este întâlnit destul de frecvent la pacienții care primesc chimioterapie, trebuie de asemenea să fie luată în calcul această influență în cazurile de monitorizare prin HE4 a evoluției bolii și a răspunsului terapeutic¹².

• Interferențe analitice

Pot produce interferențe cu unele componente ale kit-ului și conduce la rezultate neconcludente următoarele:

Bibliografie

1. Bouchard D, Morisset D, Bourbonnais Y, et al. Proteins With Whey Acidic-Protein Motifs and Cancer. Lancet Oncol, 2006, 7(2):167-74.
2. Hellström I, Raycraft J, Hayden-Ledbetter M, et al. The HE4 (WFDC2) Protein Is a Biomarker for Ovarian Carcinoma. Cancer Res, 2003, 63(13):3695-700.
3. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and Interpretive Guide. Human Epididymis Protein 4. www.labcorp.com 2015. Ref Type: Internet Communication.
4. Drapkin R, von Horsten HH, Lin Y, et al. Human Endometrioid Ovarian Carcinomas. Cancer Res, 2005, 65(6):2162-9.
5. Laborator Synevo. Referințele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2015. Ref Type: Catalog.
6. Jinping Li, Sean C Dowdy, Tracy Tipton, Karl C Podratz, Wei-Guo Lu, Xing Xie, Shi-Wen Jiang. HE4 as a Biomarker for Ovarian and Endometrial Cancer Management: HE4 Application for Endometrial Cancer. www.medscape.com.
7. Allard Jet al. Use of a novel biomarker HE4 for monitoring patients with epithelial ovarian cancer. Presentation submitted at the 2008 ASCO (American Society of Clinical Oncology) Annual Meeting. In J Clin Oncol 26: 2008.
8. Huhtinen K, Suvitie P, Hiissa J, et al. Serum HE4 Concentrations Differentiates Malignant Ovarian Tumours From Ovarian Endometriotic Cysts. Br J Cancer, 2009, 21:100(8):1315-9.
9. Moore RG, McMeekin DS, Brown AK, et al. A Novel Multiple Marker Bioassay Utilizing HE4 and CA125 for the Prediction of  Ovarian Cancer In Patients With a Pelvic Mass. In Gynecol Oncol, 2009, 112(1):40-6.
10. Moore RG, Jabre-Raughley M, Brown AK, Robison KM, et al. Comparison of a novel multiple marker assay vs the Risk of Malignancy Index for the prediction of epithelial ovarian cancer in patients with a pelvic mass. Am J Obstet Gynecol. 2010.
11. Ruggeri G, Bandiera E, Zanotti L, et al. HE4 and epithelial ovarian cancer: Comparison and clinical evaluation of two immunoassays and a combination algorithm. In Clin Chim Acta. 2011;412(15-16):1447-53. Epub 2011 Apr 30.
12. Ferraro S, Schiumarini D, Panteghini M. Human epididymis protein 4: factors of variation. Clin Chim Acta. 2015 Jan 1;438:171-7.
13. Kappelmayer J, Antal-Szalmás P, Nagy B Jr. Human epididymis protein 4 (HE4) in laboratory medicine and an algorithm in renal disorders. Clin Chim Acta. 2015 Jan 1;438:35-42.