Imunofenotipare limfocitară – profil de bază

Informaţii generale despre sistemul imun

Funcţia primară a sistemului imun este aceea de a lupta împotriva agenţilor patogeni microbieni (bacterii, paraziţi, fungi, virusuri). Sistemul imun îndeplineşte această funcţie în două moduri: în primul rând, prin generarea unui răspuns imun specific împotriva agentului patogen invadant şi controlul infecţiei; în al doilea rând, prin reamintirea acestui prim “conflict” şi declanşarea unui răspuns imun accelerat în urma reexpunerii la acelaşi agent patogen microbian³.

Sistemul imun este constituit dintr-o reţea complexă de celule, ţesuturi şi organe care participă împreună la apărarea organismului uman.

Cunoaşterea structurii şi funcţiei complexe a sistemului imun ajută la înţelegerea fundamentului deficienţelor imune congenitale sau dobândite (infecţia HIV) şi la perceperea căilor potenţiale prin care sistemul imun poate fi modulat în cazul unor boli specifice^3;9.

Organele limfoide ale sistemului imun sunt: măduva osoasă hematogenă (situsul hematopoiezei), timusul (centrul “instructajului timic”, de maturare a protimocitelor in celule T mature), splina („filtrul” imunologic al sângelui), nodulii limfatici (centrul imunologic al limfei), ţesutul limfoid asociat mucoaselor (MALT) şi ţesutul limfoid asociat tractului digestiv (GALT)^9;11. Intr-o manieră similară, macrofagele şi celulele dendritice de la nivelul splinei şi nodulilor limfatici capturează antigenele şi le prezintă limfocitelor B şi T, declanşând astfel răspunsul imun.

Celulele sistemului imun sunt: limfocitele T, limfocitele B, celulele NK, granulocitele, macrofagele/monocitele, fibroblaştii, celulele epiteliale, celulele dendritice^3;9.

Majoritatea agenţilor patogeni au o capacitate de proliferare foarte ridicată, iar prevenirea infecţiilor sistemice necesită răspunsuri adecvate şi rapide din partea sistemului imun înnăscut şi a sistemului imun dobândit¹¹.

Imunitatea nespecifică/înnăscută asigură prima linie de apărare împotriva agenţilor microbieni patogeni¹¹.

Se caracterizează prin răspunsuri imune nespecifice, rapide şi la fel de intense, indiferent de tipul agentului patogen, care destul de rar sunt suficiente pentru a elimina în totalitate infecţiile microbiene celulare şi prin lipsa memoriei imunologice sau a unei imunităţi protective de durată. Este asigurată prin intermediul barierelor anatomice (tegumente, membrane, mucoase), barierelor fiziologice (temperatura, pH), factorilor chimici (interferoni, sistemul complement), celulelor cu activitate fagocitară (macrofage/monocite, celule dendritice, neutrofile, fibroblaşti, celule epiteliale), citotoxicitaţii mediate celular (celulele NK)^3;9.

Prin producţia de mediatori (citokine, chemokine, interferoni), răspunsurile imune nespecifice stabilesc “scena“ pentru declanşarea răspunsurilor imune specifice¹¹.

Imunitatea specifică/dobândită/adaptativă este acea funcţie a sistemului imun de a recunoaşte specific antigenele şi de a dezvolta o imunitate mediată umoral, o imunitate mediată celular sau ambele, principalii “ jucători” fiind anticorpii, limfocitele B, limfocitele T şi celulele prezentatoare de antigen. Acest tip de imunitate poate fi dobândită activ (organismul gazdă produce proprii anticorpi/limfocite imunologic active, iar imunitatea este de lungă durată) sau pasiv (organismul primeşte anticorpi/limfocite imunologic active produse în timpul unui răspuns imunologic activ în alt organism, iar imunitatea este de scurtă durată). Indiferent că este vorba despre o imunitate activă sau pasivă, aceasta poate fi dobândită natural (anticorpii sunt produşi în organismul gazdă sau primiţi prin transfer placentar/alăptare) sau artificial (prin vaccinare)⁹.

O carateristică importantă a acestui tip de imunitate este memoria imunologică.

Răspunsurile imune adaptative sunt larg extinse prin stimulare antigenică, ceea ce conduce la expansiunea clonală, diferenţierea şi maturarea a diverse clone de celule B antigen specifice, pentru a produce anticorpi circulanţi (răspuns imun umoral), şi prin activarea celulelor T, derivate din timus, la răspunsuri imune celulare antigen specifice. Practic, imunitatea adaptativă depinde de reţeaua de interacţiuni foarte complexe şi intricate dintre diferitele tipuri celulare şi subseturile lor, reglate prin producţia lor de mediatori (citokine, chemokine si interferoni tip I,II )¹¹.

Celulele sistemului imun înnăscut constituie o rezervă celulară uniformă fără specificitate antigenică; pot fi recrutate în număr remarcabil de mare; sunt primele care ajung la locul infecţiei; modelul de migrare este unidirecţional, iar odată exercitată funcţia lor, celulele vor fi eliminate. În cazul celulelor specifice sistemului imun dobândit (limfocitele), acestea sunt prezente într-un număr scăzut pentru un anumit antigen şi, pentru a contrabalansa acest dezavantaj, ele urmează un mod complex de migrare, strâns dependent de statusul lor de activare şi memorie imunologică. Prezintă deci capacitatea de a recircula: reintră în circulaţia sangvină de la nivelul ţesuturilor limfoide şi migrează către un situs la distanţă. Migrarea limfocitelor este bine organizată pentru a asigura o expunere eficientă a acestora la antigenele lor înrudite de la nivelul organelor limfoide secundare. Mai mult, clonele limfocitare care prezintă anumite caracteristici relevante, cum ar fi receptorii care recunosc epitopii antigenici, nu sunt pierdute după implicarea în răspunsul imun, în schimb sunt rezervate ca “celule cu memorie” pentru a asigura răspunsuri imune specifice mai rapide şi mai puternice, în cazul reinfecţiei cu acelaşi agent patogen¹¹.

Celulele prezentatoare de antigen (APC) reprezintă un grup de celule heterogen din punct de vedere morfologic şi funcţional, provin din precursori medulari şi sunt specializate în a prezenta antigenele limfocitelor, în special celulelor T. Aceste celule profesionale prezentatoare de antigen includ monocite (prezente în sângele periferic), macrofage (monocite tisulare), celule rezidente de la nivelul organelor limfoide ale sistemului imun (celule dendritice) şi constituenţi ai sistemului monocit-macrofag din alte organe solide. Limfocitele B, care captează antigenul prin intermediul receptorilor de tip mIg (imunoglobuline de membrană), pot de asemenea să funcţioneze eficient ca APC pentru limfocitele T, prin prezentarea antigenului degradat (oligopeptid) legat de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC); limfocitele T activate vor secreta citokine care vor dirija diferenţierea limfocitelor B şi producţia de anticorpi a acestora. Caracteristica definitorie a acestor celule este exprimarea moleculelor MHC I şi II pe suprafaţa lor, precum şi a moleculelor accesorii necesare pentru activarea limfocitelor T: CD86 şi CD80. Imediat după activare, APC pot sa secrete citokine care induc funcţii specifice în celulele cărora le prezintă antigenul. Monocitele şi macrofagele sunt fagocitic active, exercitand această funcţie în special asupra antigenelor acoperite de anticorpi sau de componente ale sistemului complement care se leagă de receptorii de suprafaţă pentru Fcγ şi C3b^11;12.

Moleculele de legare a antigenelor, prin capacitatea lor de a lega antigenele străine organismului uman, sunt responsabile de specificitatea răspunsului imun dobândit. Există trei seturi de astfel de molecule: imunoglobuline (Ig), receptorul celulelor T (TCR) şi moleculele MHC, toate aceste molecule făcând parte din superfamilia de imunoglobuline (IgSF). Ig sunt alcătuite dintr-un lanţ polipetidic greu (H) şi un lanţ usor (L), de tip kappa sau lambda; acestea sunt exprimate pe suprafaţa limfocitelor B şi secretate ca anticorpi în cadrul răspunsului imun umoral. TCR se prezintă sub forma unui heterodimer alcătuit din 2 lanţuri polipeptidice H – αβ/γδ; majoritatea limfocitelor T exprimă αβ-TCR. Genele HLA situate pe cromozomul 6 codifică moleculele complexului major de histocompatibilitate MHC I şi II. Moleculele MHC I sunt formate dintr-un singur lanţ H (HLA-A, B, C), spre deosebire de moleculele MHC II care sunt alcătuite din două lanţuri H – α şi β (HLA-DQ, DR, DP). Limfocitele T care exprimă pe suprafaţa lor receptori αβ-TCR pot fi divizate în două subpopulaţii majore. Această împărţire este bazată pe clasa de molecule MHC recunoscută de receptorii αβ-TCR şi de expresia moleculelor CD4 sau CD8, care prin ataşarea de moleculele MCH contribuie la completarea legăturii moleculare intercelulare. In timp ce limfocitele CD4 recunosc antigenul legat de moleculele MHC I, limfocitele CD8 recunosc antigenul legat de moleculele MCH II; raportul limfocitelor CD4/CD8 în sângele periferic este aproximativ 2:1 (0.8:1-3:1). Toate celulele nucleate exprimă molecule MHC I şi sunt APC non-profesionale, APC profesionale exprimând molecule MHC II. Interacţiunea dintre complexul MHC-peptidul antigenic şi TCR deţine un rol esenţial în protecţia imună, deoarece un răspuns imun complet necesită intervenţia celulelor T antigen specifice. Acesta reprezintă practic un mecanism de siguranţă pentru a minimaliza posibila auto-reactivitate (reactivitate împotriva self-ului), astfel încât un limfocit T devine activat numai pentru că a întâlnit un antigen străin (non-self).

Limfocitele B provin din celulele stem hematopietice care, în mod succesiv, populează splahnopleura embrionară paraaortică, ficatul fetal şi măduva osoasă hematogenă. Celulele stem fiice dau naştere progenitorilor limfoizi multipotenti (PLM), care generează celulele mieloide sau limfoide. Astfel, PLM pot produce precursorii limfoizi comuni (PLC), iar aceştia pot genera limfocitele T, limfocitele B, celulele NK şi un subset special de celule dendritice. Diferenţierea finală spre celulele B necesită ca celulele fiice PLC să fie expuse unor micromedii specializate, aşa cum sunt cele prezente în ficatul fetal şi măduva osoasă. Trecerea de la ficatul fetal la măduva osoasă începe la mijlocul vieţii fetale şi se termină chiar înainte de naştere; celulele B continuă să fie produse în măduva osoasă pe parcursul intregii vieţi. Diferenţierea celulelor B are loc în două stadii, diferite din punct de vedere anatomic şi funcţional; astfel, primul stadiu are loc în măduva osoasă şi este antigen independent, iar cel de-al doilea stadiu are loc în organele limfoide periferice şi este antigen dependent^9;11.

Limfocitele B imature, care exprimă pe suprafaţa lor mIgM (imunoglobulina de membrană) şi BCR (receptorul celulei B), părăsesc măduva osoasă după un proces de selecţie negativă a celulelor B auto-reactive şi pătrund în periferie (sânge şi organe limfoide secundare) unde îşi completează diferenţierea în celule B mature care exprimă pe suprafaţa lor mIgM şi mIgD şi pot fi activate prin legarea de antigen¹¹.

Celulele B imature auto-reactive, ce exprimă mIgM self-reactiv, urmează un proces cunoscut ca “receptor editing“, în care un rearanjament la nivelul genelor care codifică lanţul greu al imunoglobulinelor (IgH) modifică specificitatea antigenică a receptorului. Dacă acest proces eşuează, celulele B imature auto-reactive devin anergice sau vor suferi apoptoza în urma contactului cu antigenul. Aceasta contrastează cu abilitatea celulelor B mature de a deveni activate în urma contactului antigenic¹².

BCR este un complex format dintr-o mIg şi două molecule citoplasmatice Igα/CD79a şi Igβ/CD79b. Cu ajutorul acestui receptor limfocitele B recunosc antigenul şi devin astfel activate. Implicarea BCR iniţiază o serie de evenimente care culminează cu diferenţierea celulelor B în plasmocite capabile să secrete imunoglobuline. Limfocitele B vor prezenta antigenul, recunoscut cu ajutorul BCR, limfocitelor T helper CD4 care au fost activate anterior de acelaşi antigen,  limfocitele T helper fiind selectate din pool-ul de limfocite T naive de către celulele dendritice prezentatoare de antigen. Acest proces de activare a limfocitelor B, dependent de limfocitele T, are loc prin interacţiunea dintre CD40 de pe suprafaţa celulelor B şi ligandul sau, CD145, de pe suprafaţa celulelor T helper şi prin secreţia de interleukina-4 (IL-4) de către celulele helper. Ambele semnale servesc la promovarea şi menţinerea activării iniţiate de BCR¹¹.

La nivelul organelor limfoide secundare – în zonele bogate în celule T – celulele B naive, după stimularea antigenică, urmează o expansiune clonală şi formează grupuri de celule B activate (focare extrafoliculare). Acestea se pot diferenţia în plasmocite de scurtă durată (secretoare de anticorpi cu afinitate joasă) sau migrează înapoi în foliculi şi iniţiază formarea unui centru germinativ.

După proliferare şi maturaţie, celulele B din centrul germinativ se pot diferenţia în plasmocite de lungă durată şi celule B de memorie. Majoritatea plasmocitelor de lungă durată migrează în măduva osoasă şi sunt răspunzătoare de menţinerea nivelului seric de anticorpi (anticorpi de înaltă afinitate); celulele B de memorie pot rămâne pentru o lungă perioadă de timp la nivelul organelor limfoide secundare sau pot migra şi habita în măduva osoasă^11;12. În urma contactului antigenic, celulele B de memorie răspund printr-o proliferare rapidă şi diferenţiere în plasmocite, refăcând astfel rezerva de celule B de memorie şi plasmocite.

Prin dezvoltarea tehnologiei anticorpilor monoclonali, analiza anumitor molecule de pe suprafaţa celulelor B (CD = “cluster determinants”) a ajutat la definirea stadiilor care se succed pe parcursul întregului proces de diferenţiere şi maturaţie a celulelor B (vezi tabelul 17.9.1.1):

	Celule Stem	Celule Pro-B	Celule Pre-B	Celule pre-Blate	Celule B imature	Celule B mature	Celule B activate	Plasmocite	Celule B de memorie
CD34	++	++
CD10		++	++	++	++	++
CD19		++	++	++	++	++	++	++	++
CD20		++	++	++	++	++	++	++	++
CD21		+	+	+	+	++	++	++
CD24		++	++	++	++	++	+	+
CD38		++	++				++	++	++
CD27								++	++

Tabel 17.9.1.1 Markeri pentru diferenţierea celulelor B

Limfocitele T citotoxice (CTL) şi celulele NK

Aceste două tipuri celulare, distincte din punct de vedere fenotipic, dar strâns legate prin funcţia lor citolitică (“killer”), sunt importante atât în controlul infecţiilor, cât şi în identificarea şi eliminarea celulelor tumorale. Celulele CTL sunt limfocite T CD8+ care îşi îndeplinesc funcţia de “killer“ prin două căi majore: liza mediată de perforine şi granzime ce sunt eliberate din lizozomi şi apoptoza receptor indusă (TNFR), ambele căi necesitând un contact apropriat între celula litică şi ţinta sa, în special prin interacţiunea dintre TCR şi moleculele MHC I. Răspunsul CTL la o infecţie acută are loc în trei faze: prima constă în activarea iniţială şi proliferarea CTL; a doua în contracţia celulelor T efectoare în celule T de memorie; iar a treia fază se referă la menţinerea de lungă durată a pool-ului de celule T de memorie. Celulele CTL se dezvoltă la nivelului timusului, părăsesc acest organ limfoid în stare naivă, circulă între organele limfoide secundare (splina şi ganglionii limfatici) pe calea sistemului arterial, respectiv limfatic, şi în cursul acestui pasaj întâlnesc antigenul nonself. Antigenul este adus la nivelul organelor limfoide secundare prin sistemul limfatic de către celula dendritică (APC); aceasta devine matură după achiziţia antigenului nonself la nivelul ţesuturilor non-limfoide. Deşi celula dendritica este cel mai important APC profesional, macrofagele şi celulele B sunt de asemenea capabile să prezinte antigenul. Procesul infecţios conduce la o creştere dramatică a CTL patogen/antigen specifice, iar magnitudinea acestui proces depinde de natura infecţiei şi de inoculul/doza de antigen. Această expansiune este urmată de  contracţia CTL efectoare în celule T de memorie. Un procent de 5% din populaţia celulelor efectoare expansionate supravieţuieşte sub forma celulelor de memorie de lungă durată. Este prevenită astfel afectarea tisulară nespecifică ce se poate produce prin activitatea citolitică şi eliberarea necontrolată de citokine şi este asigurată flexibilitatea CTL de a răspunde la noi infecţii.

Producţia de celule de memorie antigen, independentă de lungă durată este esenţială pentru un răspuns rapid în cazul unei reinfecţii. CTL de memorie asigură un răspuns mult mai intens decât celulele CTL naive activate primar, atât din punct de vedere cantitativ cât si calitativ. Deoarece în cursul infecţiei primare CTL suferă o expansiune clonală importantă, numărul de precursori CTL antigen specifici este mult mai mare la indivizii imunizaţi comparativ cu cei naivi, ceea ce permite un răspuns imun mai puternic. CTL de memorie prezintă o eficienţă extraordinară în elaborarea funcţiilor efectoare prin producţia rapidă de gamma-interferon (IFNγ).

Compartimentul CTL de memorie este compus din două tipuri celulare: CTL de memorie-efectoare (Tem) şi CTL de memorie-centrale (Tcm), acestea din urmă fiind capabile de o auto-reinnoire antigen-independentă homeostatică prelungită. La întâlnirea cu antigenul, aceste celule dobândesc rapid funcţia efectoare şi fenotipul celulelor Tem. Celulele CD4 şi citokinele IL-15, IL-7, IL-2 şi GM-CSF (factorul de stimulare al coloniilor pentru granulocite şi monocite) au un rol important în supravieţuirea şi menţinerea rezervei de CTL de memorie (vezi tabelul 17.9.1.2).

În final, activitatea citotoxica a CTL are loc prin două mecanisme:

MARKER	CTL naive	Tem	Tcm
CD44	+	+++	+++
Distribuţia tisulara principala	Ganglioni limfatici, splina, sange	Tesuturile non-limfoide (plaman, ficat), splina	Ganglioni limfatici, splina, sange
Funcţia citotoxica	–	++	–
IFNγ	–	+++	+

 Tabel  17.9.1.2 Proprietăţile CTL

Celulele NK aparţin liniei celulare limfoide şi sunt implicate în răspunsul imun înnăscut. În comparaţie cu CTL, celulele NK sunt de talie relativ mare, granulare şi nu necesită pre-activare pentru a recunoaste şi a liza celule tumorale sau aberante. De asemenea nu au nevoie de prezenţa moleculelor MHC I. Aceste celule sunt capabile să producă cantităţi importante de citokine şi chemokine, care le permit să moduleze răspunsul imun. IL-15 este necesară pentru a menţine nivelul homeostatic al celulelor NK in organism, activitatea de „killer” fiind exercitată în acelaşi  mod ca şi în cazul CTL.

Receptorii celulelor NK sunt clasificaţi în activatori si inhibitori şi aparţin la două familii importante de receptori: killer cell immunoglobulin-like (KIR) şi lectin-like. Prin receptorii inhibitori celulele NK recunosc moleculele MHC I de pe suprafaţa celulei ţintă şi primesc astfel un semnal inhibitor – no-killing; prin receptorii activatori recunosc liganzi celulari, virali sau induşi de stres, care transmit un semnal activator – pro-killing. In cazul în care o celulă ţintă nu exprimă moleculele MHC I pentru a evita acţiunea citolitica a CTL, aceasta va fi distrusă de către celula NK.

Celulele NK se afla într-un număr relativ redus la nivelul măduvei osoase şi splinei (<2%) şi reprezintă aproximativ 15% din numărul total de limfocite din sânge. NK sunt de obicei definite prin intermediul unei combinaţii de markeri de suprafaţa celulară (CD): CD3-, CD16+, CD56+. Astfel pot fi clasificate în două subseturi, în funcţie de exprimarea CD16 şi CD56:

Celulele T helper-CD4, în mod similar celulelor TCR+, se diferenţiază la nivelul timusului din celulele progenitoare comune limfoide, în cea mai mare parte în timpul vieţii fetale şi imediat după naştere. Iniţial, celulele T nu exprimă TCR şi sunt CD3-/CD4-/CD8- (triplu negative). Etapele de diferenţiere timică includ stadiile:

Celulele T naive, pozitive pentru un singur CD (CD4 sau CD8) părăsesc timusul şi recirculă din sânge în ariile timus-dependente (TDA) ale organelor limfoide secundare. În majoritatea răspunsurilor imune, activarea celulelor T CD4+ are loc în TDA ale organelor limfoide secundare, iar celulele prezentatoare de antigen sunt reprezentate de celulele dendritice. Prezentarea eficientă a antigenului non-self stimulează activarea, proliferarea şi diferenţierea limfocitelor CD4+ în trei categorii funcţionale: celule CD4+ cu activitate proinflamatorie, celule CD4+ cu activitate reglatoare/antiinflamatorie şi celule CD4+ ce funcţionează ca celule de memorie. Diferenţierea dintre celulele T naive, efectoare şi de memorie se face pe baza moleculelor exprimate pe suprafaţa lor (vezi tabelul 17.9.1.3).

Celulele CD4+ efectoare sunt cele care susţin procesele inflamatorii prin eliberarea de citokine, fiind divizate în trei categorii: Th1 , Th2, Th17^11;12.

Celulele T reglatoare (Treg)

Pentru a preveni răspunsurile imune auto-distructive şi a permite cele protective împotriva antigenelor non-self, sistemul imun a dezvoltat o serie de mecanisme reglatoare care au rolul de a inhiba generarea de limfocite T şi B self-reactive potenţial dăunătoare – toleranţa imună centrală – şi de a scădea activarea celulară şi expansiunea limfocitelor atunci când acestea întâlnesc antigene self – toleranţa imună periferică.

Au fost descrise mai multe tipuri de celule T cu activitate reglatoare: celule T TCRγδ +, celule NK, limfocite T CD8+ şi limfocite T CD4+.

Celulele T CD4+ reg pot fi divizate în două categorii: celulele Treg care apar natural (generate în timus) şi celulele Treg induse (Treg 1 care secretă IL-10, Th3 care secretă TGFβ), diferenţiate din celulele T naive. Celulele T CD4+ reg derivate din timus sunt CD25+ şi se găsesc într-un procent de 30%, însă doar 2-4% din celule Treg CD25high+ au proprietăţi supresive. Un alt marker important este factorul de transcripţie FOXP3 care este exprimat în mod specific la nivelul celulele Treg timic derivate. Majoritatea celulelor FOXP3 + sunt celule CD4+CD25 bright+ şi doar câteva sunt celule CD25- şi CD25 low+¹¹.

Celulele T de memorie

Nivelul protecţiei imune se corelează cu numărul de celule T de memorie antigen specifice. In cursul infecţiei primare există o expansiune importantă a rezervei de celule T CD4+ şi celule T CD8+ specifice antigenului patogen. Numeroase studii demonstrează faptul că mărimea rezervei de celule T de memorie depinde de mărimea „exploziei” de celule T antigen specifice din timpul fazei de expansiune. Celulele T de memorie pot fi clasificate în: celule T centrale de memorie şi celule T efectoare de memorie.

Trebuie reţinut că celulele T de memorie pot prolifera şi produce citokine ca răspuns la o stimulare cu o cantitate mai mică de antigen, cu o costimulare mai slabă şi mult mai rapid comparativ cu celulele T naive. In plus, ele pot promova şi intensifica funcţia APC şi accelera activitatea celulelor T naive.

În absenţa stimulării antigenice, celule T de memorie pot suferi o proliferare homeostatică pentru a-şi reface rezerva. Celulele T de memorie CD4+ şi CD8+ îşi pot păstra responsivitatea lor rapidă în absenţa stimulului antigenic şi sunt capabile să confere o imunitate protectivă^11;12.

MARKER	Celule T naive	Celule T efectoare	Celule T de memorie
CD62L	H	L	H/L
CCR7	H	L	H/L
CD45RA	H	L	H/L
CD45RO	L	H	L/H

Tabel 17.9.1.3  Markeri pentru diferenţierea celulelor T

H = exprimare marcată; L= exprimare slabă                                                              

Profilul imun de bază şi recomandări pentru efectuarea acestui test

În cadrul profilului de bază sunt determinate atât procentual cât şi în valoare absolută principalele subseturi de limfocite implicate în răspunsul imun, prin identificarea markerilor de suprafaţă specifici (moleculele CD):

Principala aplicaţie a determinării subclaselor limfocitare este screening-ul, evaluarea şi monitorizarea deficienţelor imune, caracterizate prin infecţii recurente, unele ameninţătoare de viaţă, ce pot fi bacteriene, virale şi/sau fungice în funcţie de natura deficienţei.

Imunodeficienţele primare (congenitale) sunt afecţiuni rar întâlnite, cu o frecvenţă estimată la 1/10000 naşteri vii, în schimb mult mai frecvente sunt imunodeficienţele secundare din boli maligne limfo-reticulare, boli autoimune, tratamente imunosupresoare, infecţii virale, deficienţe nutriţionale, boli cu pierdere de proteine.

Deficienţele imune celulare pot fi numerice sau funcţionale, putând fi implicate neutrofilele sau limfocitele. Pe baza hemogramei poate fi depistat un număr scăzut al uneia din clasele de leucocite, însă numărul total de limfocite este inadecvat pentru investigarea unei deficienţe imune, fiind necesară cuantificarea separată a principalelor subseturi limfocitare B, T si NK prin citometrie în flux.

Pentru identificarea deficitelor imune celulare funcţionale sunt disponibile teste funcţionale.

Sunt descrise peste 200 tipuri de imunodeficienţe primare, aproximativ 170 dintre ele având defecte genetice identificate. Heterogenitatea clinică şi imunologică a acestor afecţiuni face ca diagnosticul să fie dificil, necesitând corelarea datelor clinice şi radiologice cu teste imunologice şi genetice.

Imunofenotiparea limfocitară cu determinarea cantitativă a subseturilor de limfocite face parte dintr-un spectru complex de teste diagnostice ce pot fi efectuate prin citometrie în flux, cum ar fi identificarea unor proteine anormale specifice unei anumite boli, precum şi teste funcţionale, acestea constituind în general apanajul unor laboratoare specializate.

Informaţiile obţinute pe baza imunofenotipării, în corelaţie cu alte date clinice şi de laborator, permit selecţia testelor ulterioare necesare pentru diagnosticul de certitudine, în special teste genetice.

 – Imunodeficienţa comună variabilă (CVID) include un grup heterogen de boli, având prevalenţa cea mai mare între imunodeficienţele primare. CVID se caracterizează prin anomalii ale limfocitelor B, au prezentare bimodală, în copilăria timpurie, respectiv între 15-40 ani, 4 mutaţii genetice diferite fiind asociate cu aceasta. Pacienţii se prezintă cu infecţii sino-pulmonare recurente, hipogamaglobulinemie globală şi număr de limfocite B normal sau scăzut, 5-10% din pacienţi prezentând niveluri foarte scăzute ale limfocitelor B (<1% din leucocite).

Un subset de pacienţi (5-10%) dezvoltă granuloame non-cazeoase sarcoid-like în diferite organe şi o deficienţă progresivă a limfocitelor T, în unele cazuri cu număr de limfocite T CD4+ <200/μL.

Dintre toţi pacienţii cu CVID, 25-30% prezintă un număr crescut de limfocite T CD8+ şi raport CD4+/CD8+ scăzut (<1).

 – Agamaglobulinemia se caracterizează prin debut la vârsta de 4-6 luni, cu infecţii sino-pulmonare şi gastro-intestinale recurente, hipogamaglobulinemie globală, număr foarte scăzut sau absenţa limfocitelor B circulante, incapacitatea producerii de anticorpi ca răspuns la antigene, inclusiv vaccinuri, hipoplazia ţesuturilor limfoide secundare.

În 85% din cazuri prezintă transmitere X-linkată şi se caracterizează prin defecte ale expresiei Btk (Bruton`s tyrosine kinase) pe limfocite, monocite şi trombocite ca urmare a unor mutaţii la nivelul genei BTK.

Agamaglobulinemia X-linkată poate fi confundată cu CVID la adulţi datorită suprapunerii principalelor caracteristici, însă numai 5% din cazurile de CVID prezintă <1% limfocite B CD19+ circulante.

Confirmarea diagnosticului se bazează pe evaluarea prin citometrie în flux a proteinei Btk, respectiv identificarea mutaţiei la nivelul genei BTK.

 – Imunodeficienţa severă combinată (SCID) este un sindrom cu potenţial letal, caracterizat prin infecţii recurente, dermatită, diaree şi eşecul suptului. Este cauzat de defecte moleculare numeroase, care determină anomalii numerice şi funcţionale ale limfocitelor B, T şi, ocazional, NK, dar în majoritatea cazurilor limfocitele T sunt absente sau prezintă niveluri foarte scăzute. Pe baza unui algoritm bazat pe prezenţa sau absenţa limfocitelor B şi NK la pacienţii cu niveluri foarte scăzute sau absenţa limfocitelor T, se pot selecta testele ulterioare necesare pentru stabilirea diagnosticului. Diagnosticul corect permite instituirea promtă a tratamentului şi, în ultimă instanţă, transplantul de măduvă osoasă care asigură supravieţuirea pacientului.

Un exemplu de SCID este sindromul Ommen, caracterizat prin diferenţierea parţială a limfocitelor T datorită unei mutaţii hipomorfe la nivelul genei RAG1 (recombinase activating gene 1) sau RAG2. La aceşti pacienţi, spre deosebire de pacienţii cu mutaţii care determină pierderea completa a funcţiei genei şi la care lipsesc complet limfocitele B si T, păstrează o activitate recombinantă V(D)J parţială şi pot genera o cantitate substanţială de celule T oligoclonale. Totuşi limfocitele B sunt complet absente şi, în ciuda unui nivel crescut de IgE, nu poate fi detectat un răspuns de anticorpi antigen-specifici. Clinic sindromul se caracterizează prin dermatită, diaree, limfadenopatie, hepatosplenomegalie şi susceptibilitate extremă la infecţii. Pacienţii prezintă limfocitoza prin prezenţa unui set de celule TH2 oligoclonale activate antigen-stimulate, precum şi eozinofilie.

Deficienţa MHC clasa a II-a (iniţial cunoscută ca sindromul limfocitelor goale) este o formă de SCID caracterizată prin absenţa expresiei moleculelor MHC II pe suprafaţa celulară, cu număr normal de limfocite B şi T, dar număr scăzut de limfocite T CD4+. Pentru precizarea diagnosticului, prin citometrie în flux poate fi demonstrată absenţa moleculelor MHC clasa II de pe suprafaţa celulelor prezentatoare de antigen, respectiv limfocitele B sau celulele de linie monocit-macrofag.

 – Sindromul DiGeorge este o imunodeficienţă primară cu o frecvenţă de 1/3000 naşteri vii, caracterizată prin hipocalcemie datorată hipoparatiroidismului, defecte cardiace şi hipoplazie sau aplazie timică. Acesta este cunoscut sub diferite nume: sindromul velo-cardio-facial, sindromul Shprintzen, CATCH 22, anomalia facială conotruncală, toate reprezentând aceeaşi condiţie genetică, respectiv deleţia cromozomului 22q11.2, care poate avea expresie clinică diferită. Sindromul DiGeorge “complet” cu absenţa totală a timusului şi imunodeficienţă severă reprezintă <0.5% din pacienţi. Majoritatea pacienţilor au un defect parţial cu alterarea dezvoltării timusului şi anomalii variabile ale limfocitelor T, cu o incidenţă crescută de infecţii şi boli autoimune. Imunodeficienţa se datorează numărului scăzut de limfocite T, al celulelor T reglatoare naturale (nTreg), şi, deşi numărul total de limfocite B este normal, este scăzut numărul limfocitelor B de memorie.

Alte indicaţii ale imofenotiparii limfocitare – profil de bază sunt:

• Monitorizarea imună după terapie imunosupresoare pentru transplant, boli autoimune, boli neoplazice.
• Utilizarea majoră a imunofenotipării în transplant este reprezentată de monitorizarea tratamentului cu globulina anti-timocitară, un nivel de celule T CD3+ de 50/μL fiind considerat pragul pentru tratament.
• Evaluarea reconstituirii imune post-transplant de celule stem hematopoietice.
• Determinarea numărului absolut de celule B circulante la pacienţii cu leucemie limfoidă cronică, o valoare de >5×10⁹/L fiind necesară pentru diagnosticul de LLC conform ghidurilor 2008 pentru diagnostic şi tratament în LLC.

Specimen recoltat – sânge venos⁵. 

Recipient de recoltare – vacutainer ce conţine EDTA ca anticoagulant⁵.

Volum probă – 5 mL sânge³.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este contraindicată refrigerarea probei⁵.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate, probe refrigerate sau congelate⁵.

Metodă – citometrie în flux⁵.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Buletinul final va conţine intervalele de referinţă pentru subseturile limfocitare adecvate vârstei pacientului împreună cu o interpretare a rezultatelor obţinute⁵.

Trebuie cunoscut faptul că numărul absolut al populaţiilor limfocitare este influenţat de o serie de factori biologici, inclusiv hormoni, temperatură şi mediul înconjurător. Studiile legate de variaţiile circadiane au demonstrat o creştere progresivă a numărului de celule CD4+ în cursul zilei, în timp ce limfocitele CD8+ şi limfocitele B CD19+ cresc doar în prima parte a zilei, fără a se modifica în cursul după-amiezei. Din acest motiv, atunci când se efectuează o monitorizare seriată a populaţiilor limfocitare se recomandă ca probele de sânge să se recolteze în acelaşi moment al zilei⁸.

 

Bibliografie: