Mutații K-ras în tumori de colon

Gena KRAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog), omologul celular uman al oncogenei izolate din virusul Kirsten al sarcomului şobolanului, face parte din familia RAS de proto-oncogene care include şi două alte gene: HRAS şi NRAS. Toate genele RAS au o structură intron-exon similară, iar proteinele codificate sunt GTP-aze (proteine G care leagă GDP/GTP şi acţionează ca transductori ai semnalului intracelular) cu rol important în procesele de proliferare, diferenţiere şi apoptoză celulară. Mutaţiile genelor RAS sunt frecvent asociate cu diverse tipuri de tumori (20-30% din totalul tumorilor umane); este suficientă o singură mutaţie punctiformă pentru a transforma genele RAS în oncogene potente^1;5.

In 1982 Chang şi colaboratorii săi au izolat clonele corespunzătoare genei KRAS din băncile de ADNc placentar şi embrionar uman; au fost izolate 2 izoforme denumite KRAS1 şi KRAS2. Un an mai târziu McCoy a caracterizat gena KRAS izolată din linia celulară umană de adenocarcinom de colon (SW480) şi a stabilit că aceasta corespunde izoformei KRAS2 identificată de Chang. Ulterior gena KRAS2 a fost amplificată în câteva linii celulare tumorale. In 1983 McGrath a clonat genele KRAS1 şi KRAS2, KRAS1 fiind identificată ca pseudogenă. Gena KRAS2 are 6 exoni, este localizată pe braţul scurt al cromozomului 12 şi codifică o proteină alcătuită din 188 aminoacizi, cu o masă moleculară de 21.66 kDa; comparaţia între cele 2 gene KRAS a demonstrat că în cazul KRAS1 lipsesc anumite secvenţe de intervenţie, concluzia fiind că aceasta este o pseudogenă copiată dintr-un ARNm procesat al KRAS2 şi încorporată în cromozomul 6. Transcriptul ARNm  KRAS2 major are o lungime de 5.5 kb; în urma splicing-ului alternativ al exonului 5 se formează două izoforme A şi B care diferă în regiunea C-terminal. In ARNm KRASB exonul 6 codifică regiunea C-terminală; în ARNm KRASA acelaşi exon codifică regiunea netranslatată 3’. Regiunile C-terminale diferite ale celor două izoforme vor suferi modificări post-translaţionale. Procesarea post-tanslaţională diferenţiată are efecte funcţionale marcate ce conduc la căi de semnalizare şi localizări alternative ale proteinei⁵.

Proteina K-Ras funcţionează ca un “comutator” ce este deschis şi închis de către moleculele de GTP şi respectiv GDP. In stare activă, legarea GTP induce ataşarea de membrana celulară; hidroliza GTP la GDP permite revenirea la forma inactivă, disocierea de membrană şi inactivarea transmiterii semnalului la nucleu¹. Proteina K-ras este recrutată de către receptorul EGFR activ pentru a iniţia cascada de semnalizare pe calea RAS/MAPK⁴.

EGFR (epidermal growth factor receptor = receptorul pentru factorul de creştere epidermică) aparţine familiei de receptori tirozin kinazici pentru factori de creştere. Reprezintă veriga de legătură între spaţiul extracelular şi transducţia intracelulara a semnalului; este alcătuit dintr-un receptor extracelular, un domeniu transmembranar lipofilic şi un domeniu intracelular cu proprietăţi de tirozin kinaza. EGFR este activat extracelular de către liganzi cum ar fi EGF (epidermal growth factor = factor de creştere epidermică) sau TGF-alfa (transforming growth factor – alpha = factorul transformator al creşterii), ce determină homodimerizarea receptorului. Rezultă autofosforilarea receptorului tirozin kinazic care declanşează diverse cascade de transmitere a semnalului în care proteina K-ras joacă un rol important⁶.

Mutaţiile somatice activatoare ale genei KRAS determină schimbarea unui singur aminoacid şi conduc la activarea constitutivă a proteinei K-ras, prin impiedicarea hidrolizei GTP (proteina se găseşte permanent în forma activă legată de GTP). Activarea proteinei K-Ras se face în aval de fosforilarea tirozin kinazei EGFR; în continuare transducţia semnalului este legată de RAF (root abundant factor), MEK (MAP kinaza, ERK kinaza) şi ERK (extracellular regulated MAP-kinaza), ce conduce în final la transcripţia genelor care influenţează apariţia şi progresia tumorilor. Astfel se explică implicarea mutaţiilor KRAS în mai multe tipuri de cancer, în special pancreatic, pulmonar şi colorectal^2;6.

Cancerul colorectal, ce include tumorile maligne de la nivelul colonului, rectului şi apendicelui, este a treia cea mai frecventă formă de cancer şi a doua cauză de deces conform WHA (World Health Asssociation). Mutaţii KRAS au fost identificate în 40% din carcinoamele colorectale non-ereditare, ce constituie 90% din totalul carcinoamelor colorectale. Studii efectuate pe pacienţii proveniţi din familii cu cancer colorectal non-polipozic ereditar (HNPCC) au demonstrat că mutaţiile genei KRAS sunt independente de detectarea instabilităţii microsatelite, iar frecvenţa mutaţiilor în cazurile de carcinom ereditar este comparabilă cu cea din cazurile sporadice⁶. Mutaţiile KRAS constituie în majoritatea cazurilor un eveniment precoce în dezvoltarea şi progresia cancerelor colorectale. Câteva studii au demonstrat că statusul KRAS este un factor important de prognostic.  Astfel, mutaţiile KRAS sunt asociate cu tumori în stadiu mai avansat, cu un potenţial metastatic crescut şi cu un prognostic scăzut. Până în prezent au fost comunicate peste 3000 de mutaţii punctiforme KRAS în cancerul colorectal (www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/). In majoritatea cazurilor anomaliile sunt detectate în codonii 12 (~82% din toate mutaţiile KRAS) şi 13 (~17%) ai exonului 2; se pare că aceste mutaţii punctiforme missense au un rol important în progresia cancerului de colon². Mutaţiile cele mai obişnuite sunt următoarele: Gly12Asp, Gly12Ala,Gly12Val, Gly12Ser, Gly12Arg, Gly12Cys şi Gly13Asp⁴.

Statusul mutaţiilor KRAS are de asemenea impact şi asupra deciziilor terapeutice la pacienţii cu cancer colorectal. Luând în considerare importanţa axei EGFR menţionate mai sus, au fost dezvoltate medicamente care interferă cu domeniile funcţionale ale receptorului; sunt descrise astfel două clase de antagonisti EGFR: anticorpi monoclonali anti-EGFR, care se leagă de domeniul extracelular EGFR şi intră în competiţie cu liganzii naturali blocand activarea receptorului, şi molecule mici de inhibitori ai tirozin kinazei EGFR, care intră în competiţie cu ATP-pentru legarea domeniului catalitic intracelular al tirozin kinazei (vezi figura 1). La ora actuală au fost aprobate două preparate de anticorpi monoclonali anti-EGFR în tratmentul cancerului colorectal: Cetuximab (un anticorp monoclonal IgG1 chimeric provenit de la om şi şoarece) şi Panitumumab (un anticorp monoclonal IgG2k uman). A fost dovedit că ambele preparate reduc riscul de progresie a tumorii şi îmbunătăţesc supravieţuirea globală, perioada de supravieţuire fără progresie a bolii, precum şi calitatea vieţii la pacienţii cu cancer colorectal refractar la tratament. Cu toate acestea, studiile au arătat că nu toţi pacienţii răspund la aceşti agenţi care au drept ţintă moleculară EGFR. Deoarece terapia este costisitoare şi este însoţită de reacţii adverse este esenţial să se identifice pacienţii care pot beneficia într-adevăr de aceasta^2;4;6.

Literatura de specialitate furnizează informaţii conform cărora mutaţii în gena KRAS conferă rezistenţă faţă de anticorpii monoclonali anti-EGFR; mutaţiile sunt asociate cu răspuns slab la terapie deoarece acestea activează constitutiv calea RAS/MAPK în aval de EGFR, iar terapia anti-EGFR care împiedică legarea ligandului la EGFR nu îşi poate exercita efectul inhibitor asupra proliferării celulare. Concluzionând, statusul genei KRAS este un parametru important în selectarea pacienţilor pentru terapie: pacienţii cu mutaţii nu pot beneficia de terapia anti-EGFR. Pe baza acestor date, Agentia Europeana a Medicamentului (EMEA) a aprobat folosirea cetuximabului şi panitumumabului în tratamentul cancerelor metastatice la pacienţii care au gena KRAS de tip sălbatic (normală)².

Mutaţiile KRAS sunt detectate cu ajutorul unor teste moleculare pe probe de ţesut tumoral conservat în parafină⁶. In general, un bloc de parafină care conţine un material ce provine de la un adenom sau de la un carcinom neinvaziv nu trebuie folosit pentru testarea mutaţiilor KRAS. In cazul în care se efectuează o biopsie pe cale endoscopică din tumora primară sau dintr-o metastază patologul trebuie să se asigure că există celule tumorale în materialul prelevat şi să indice blocul sau lamele care trebuie utilizate în ţestul molecular.

Fig. 1 Căile de transducţie controlate de activarea EGFR şi blocarea terapeutică a EGFR; activarea EGFR indusă de ligand duce la activarea a trei căi de transducţie importante, RAS-MAPK, PI3K-Akt şi STAT, care controlează transcripţia, progresia, proliferarea celulară, adeziunea, angiogeneza şi migrarea celulară. Anticorpii monoclonali anti-EGFR se leagă de domeniul specific extracelular al receptorului, inhibă legarea ligandului şi automat activarea EGFR. Molecule inhibitoare ale EGFR inhibă fosforilarea, activarea căilor de transducţie şi implicit proliferarea celulară(Adaptare dupa Ensari et al.)

In cadrul testării mutaţiilor KRAS se folosesc în primă etapa tehnici de amplificare PCR; în funcţie de ţesutul analizat, raportul ţesut tumoral versus ţesut sănătos este variabil şi heterogen, rezultând un amestec al ţintei de amplificat în care ADN-ul mutant şi cel sălbatic nu sunt prezente într-un raport echimolar. De aceea este important ca pentru genotipare ţesutul selectat să conţină suficient material tumoral pentru analiza (mai mult de 70% celule de carcinom invaziv). Ulterior are loc secvenţierea exonului 2 al genei KRAS în vederea detectării mutaţiilor².

Recomandări pentru analiza mutaţiilor genei KRAS

Analiza mutaţiilor genei KRAS contribuie semnificativ la selectarea pacienţilor care pot beneficia de terapia cu anticorpi monoclonali anti–EGFR. Testul genetic se indică la pacienţii cu tumori metastatice (stadiul IV)^4;6.

Specimen recoltat – secţiuni nefixate, necolorate din ţesut  conservat în parafină (4-5 lame); cu ajutorul unui marker cariocă vor fi evidenţiate zonele în care este prezent ţesutul tumoral³.

Metoda – secvenţierea exonului 2³.

Raportarea rezultatelor

Va fi comunicată prezenţa sau absenţa unei mutaţii la nivelul codonului 12 sau 13 din exonul 2 al genei KRAS în ADN-ul extras din ţesutul tumoral colonic^3;4.

Limite şi interferente

Nu toţi pacienţii care prezintă gena KRAS de tip sălbatic răspund la terapia anti-EGFR. Au fost descrise polimorfisme rare care pot conduce la rezultate fals-pozitive sau fals-negative⁴.

Bibliografie