Test Coombs direct

Sinonime – test antiglobulinic direct.

Informaţii generale

Demonstrarea prezenţei de imunoglobuline sau a complementului pe suprafaţa hematiilor susţine diagnosticul de distrucţie eritrocitară mediată imun¹.

Există două clase majore de anticorpi care reacţionează cu eritrocitele. Anticorpii compleţi sau salini aglutinează eritrocitele suspendate în soluţie salină; aceştia sunt de obicei de tip IgM (cel mai bun exemplu de aglutinare salină la temperatura camerei este cea utilizată în grupajul ABO). In vivo anticorpii IgM fixează complementul şi produc hemoliza imediată intravasculară. Anticorpii care nu reacţionează vizibil în mediu salin şi produc reacţii de aglutinare numai prin utilizarea de tehnici speciale sunt numiţi aglutinine incomplete şi sunt de obicei de tip IgG (cel mai bun exemplu sunt anticorpii anti-Rh, care, dacă sunt prezenţi în serul primitorului de sânge incompatibil, produc o reacţie hemolitică transfuzională întârziată, extravasculară)².

Pentru a certifica faptul că hematiile unui pacient sunt învelite (sensibilizate) cu imunoglobuline, complement sau ambele, se adaugă la o suspensie de eritrocite provenite de la pacient antiser cu reactivitate faţă de moleculele de Ig şi/sau complement umane, care va determina aglutinarea acestora. Iniţial testarea se face cu antiseruri polispecifice, care conţin anti-IgG, anti-C3d şi ocazional şi activitate anti-lanţ uşor. Reactivii monospecifici diferenţiază în continuare între IgG, C3d, existând şi seruri monospecifice pentru C3b, C4b, C4d şi lanţul greu al IgG. Antiseruri specifice pentru IgM sau IgA sunt rar utilizate, deoarece IgM nu mai sunt găsite de obicei încă ataşate pe suprafaţa celulară, iar IgA sunt foarte rar întâlnite pe suprafaţa eritrocitelor¹.

Utilizând sânge recoltat pe EDTA sau pe citrat activarea in vitro a complementului de către autoanticorpii la rece benigni este inhibată. Spălarea eritrocitelor îndepărtează globulinele solubile sau ataşate nespecific, ceea ce permite detecţia imunoglobulinelor şi factorilor complementului specific legate de eritrocite in vivo³.

Recomandări pentru efectuarea testului Coombs direct

• investigarea reacţiilor transfuzionale acute sau întârziate (demonstrarea fixării pe suprafaţa eritrocitelor de la donator a aloanticorpilor prezenţi în serul pacientului);
• suspiciune de hemoliză autoimună;
• boala hemolitică a nou-născutului;
• hemoliză imună indusă de medicamente;
• atunci când martorul auto efectuat în cadrul grupajului sanguin, screening-ului prezenţei de aloanticorpi şi testelor de compatibilitate este pozitiv³.

Pregătire pacient – nu este necesară o pregătire prealabilă⁴.

Specimen recoltat – sânge venos⁴.

Recipient de recoltare – vacutainer cu K3-EDTA⁴.

Cantitate recoltată – cât permite vacuumul⁴.

Cauze de respingere a probei – specimen coagulat⁴.

Stabilitate probă – testul se efectuează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, proba se păstrează 48 ore la 2-8°C⁴.

Prelucrare necesară după recoltare – o parte din eritrocite se spală de trei-patru ori cu soluţie salină normală, urmată de prepararea unei suspensii eritrocitare în ser fiziologic steril 5%^4;5.

Metode de determinare

În laboratoarele Synevo se utilizează următoarele metode:

1. hemaglutinare pe lamă cu antiglobulină umană polispecifică
2. aglutinare şi gel-filtrare pe carduri cu microtuburi ce conţin reactivi monospecifici anti-IgG şi anti-C3d.
3. metoda de aderenţă în fază solidă (în Laboratorul Central Synevo), în godeuri căptuşite cu proteina A (component al peretelui celular Staphylococcus aureus cu afinitate mare faţă de porţiunea Fc a imunoglobulinelor). Plăcile de lucru (Solidscreen I ) conţin 12 stripuri test cu câte 8 godeuri fiecare. (1 godeu = 1 test). Într-o primă etapă, suspensia de hematii de testat (preparată automat cu o soluţie cu încărcătură ionică scăzută, ce accelerează reacţia antigen – anticorp) este pipetată în godeul de lucru. Probele sunt mixate, apoi centrifugate. Supernatantul este aspirat, urmând două etape de spălare –centrifugare, pentru îndepărtarea excesului de anticorpi. Serul polispecific anti – globulină umană adăugat ulterior, se va lega atât de anticorpii şi/sau complementul de pe suprafaţa hematiilor (daca aceştia sunt prezenţi) cu porţiunea Fab, cât şi de proteina A cu porţiunea Fc, inducând astfel faza solidă, de aderenţă. În etapa finală proba este iar centrifugată.

Menţiune: serul polispecific anti – globulină umană conţine un amestec de anticorpi policlonali anti – IgG şi anti – C3 ( iepure ) si anticorpi monoclonali murini, anti – C3d. Componentul anti – IgG prezintă reactivitate faţă de lanţul uşor al IgG, prin urmare, poate interacţiona şi cu hematiile acoperite cu anticorpi de tip IgA si IgM. Componentul anti – complement va reacţiona atât cu fracţiunea C3b, cât şi cu fracţiunea C3d⁴.

Valori de referinţă – negativ⁴.

Interpretarea rezultatelor

În cazul metodei de hemaglutinare pe lamă rezultatul se raportează negativ/pozitiv în funcţia de absenţa/prezenţa aglutinatelor eritrocitare.

Pentru metoda de aglutinare pe carduri o reacţie pozitivă se validează numai dacă microtubul de control este negativ. Reacţia pozitivă se apreciază in funcţie de dispersia aglutinatelor în microtub de la + la ++++, astfel : – rezultat pozitiv ( ++++) ; – rezultat slab pozitiv ( + pana la +++ ) ; – rezultat negativ ( – ). De asemenea, în cazul unui rezultat pozitiv se va raporta specificitatea anti-IgG şi/sau anti-C3d.

În cazul metodei de aderenţă, fiecare godeu al stripului de lucru este evaluat şi fotografiat automat de către analizor, rezultatele fiind interpretate astfel:

• Reacţie pozitivă (prezenţa anticorpilor şi/sau a complementului la suprafaţa celulelor) – hematii dispuse în strat uniform pe pereţii godeului (faza solidă); intensitatea este apreciată de la 1+ la 4+
• Reacţie negativă – buton compact de hematii sedimentate în mijlocul godeului
• Reacţie neconcludentă – reacţia +/- se va interpreta de către medic

Toate imaginile şi rezultatele obţinute sunt verificate şi validate de medic⁴.

 Test Coombs direct pozitiv se asociază cu următoarele entităţi^1;2;3;6:

Limite şi interferenţe^1;3

• spălarea inadecvată a celulelor şi concentraţia mare de imunoglobuline în serul pacientului influenţează testul.

În cazul obţinerii unui rezultat pozitiv trebuie luate în considerare următoarele posibilităţi:

• profilaxie antepartum la mamă cu imunoglobuline anti-D;
• prezenţa de autoanticorpi la cald benigni, fără acţiune hemolitică;
• modificări ale membranei eritrocitare induse de medicamente (ex.: cefalosporine) cu adsorbţia nespecifică de proteine;
• adsorbţia nespecifică de globuline asociată cu hipergamaglobulinemia sau paraproteinemia;
• activarea in vitro a complementului de către autoanticorpi la rece benigni (ca de exemplu în sângele coagulat după răcire);
• poliaglutinare, dacă sunt expuse criptoantigene (T), iar reactivul este contaminat cu anti-T.

Bibliografie